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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 蛇血清磷脂酶A2 抑制劑的抗炎癥作用初探
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 在人體中，PLA2是整個(gè)炎癥通路的總開(kāi)關(guān)，其過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致下游炎癥介質(zhì)的大量釋放，進(jìn)而導(dǎo)致了臨床上的炎癥性疾病。從源頭上抑制PLA2的過(guò)度表達(dá)是防止此類炎癥性疾病的重要思路。于是我們根據(jù)“酶-抑制劑”的關(guān)系以及自然界中的解毒關(guān)系，結(jié)合生物信息學(xué)和分子結(jié)構(gòu)擬合，分析了PLA2活性中心，最終篩選到了天然特異性PLA2抑制劑，并且得到了具有活性的多肽序列，為后續(xù)的藥物研究打下了基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- 分泌型磷脂酶A2（sPLA2）是人體代謝網(wǎng)絡(luò)中非常重要的一種酶，它是花生四烯酸炎癥信號(hào)通路的“總開(kāi)關(guān)”。sPLA2 的過(guò)度表達(dá)或過(guò)早激活是重癥急性胰腺炎、急性缺血性腦損傷、冠心病、腫瘤等多種疾病的重要原因。針對(duì)這個(gè)通路，目前臨床藥物主要有兩類：一類為花生四烯酸分解酶COX 抑制劑，另一類是sPLA2 非特異性抑制藥物，兩類藥物共有特點(diǎn)是副作用較大。因此，尋找高特異性、低副作用的sPLA2抑制劑，是亟待解決的問(wèn)題。自然界，蛇毒中的sPLA2 含量最為豐富，且為其主要的毒性成分，而一些蛇血清具有中和蛇毒毒性的作用。因此，蛇血清是sPLA2 抑制劑的重要來(lái)源。通過(guò)生物信息學(xué)，對(duì)蛇毒sPLA2 活性中心進(jìn)行了研究，并對(duì)人源和蛇源sPLA2 進(jìn)行了一級(jí)序列比對(duì)。采用Swiss-model 同源建模方法預(yù)測(cè)各種sPLA2 的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并用UCSF Chimera 軟件對(duì)兩種來(lái)源sPLA2 的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)人源和蛇源sPLA2 一級(jí)結(jié)構(gòu)相似度為35%-49%，三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度超過(guò)95%。這表明，蛇血清sPLA2 抑制劑極可能對(duì)人sPLA2 有抑制作用，這充分展現(xiàn)出了其廣泛的臨床應(yīng)用前景。在生物信息學(xué)研究基礎(chǔ)上，我們對(duì)蛇血清PLI（Phospholipase A2 Inhibitor）進(jìn)行了篩選與純化。利用Source 30Q 層析柱，從五步蛇蛇毒中分離得到一個(gè)中性sPLA2，活性測(cè)定表明其具有強(qiáng)烈的sPLA2 酶活性和出血毒性。以該sPLA2 為靶酶，對(duì)某省常見(jiàn)六種蛇（華游蛇、王錦蛇、頸棱蛇、金環(huán)蛇、銀環(huán)蛇、眼鏡蛇）血清進(jìn)行了篩選。初篩結(jié)果表明：頸棱蛇和華游蛇血清sPLA2 抑制活性最高?；诔鹾Y結(jié)果和資源量，確定以華游蛇血清為原料，分離純化sPLA2抑制劑。通過(guò)Source 30Q、超濾、Uno Q 柱精純化等三個(gè)步驟，從華游蛇血清中純化得到一個(gè)PLI，SDS-PAGE 表明該蛋白含有25.4Ku 和21.2Ku 兩個(gè)亞基，初步推測(cè)該蛋白為γ 型PLI。另經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)于人GIIPLA2 也有良好抑制活性，且抑制效果顯著優(yōu)于氯喹。基于各種 PLI 序列和文獻(xiàn)，通過(guò)生物信息學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)PLI 是以β-轉(zhuǎn)角為特征的、含有芳香族氨基酸或類似苯環(huán)的結(jié)構(gòu)，主要與sPLA2疏水性通道結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。我們篩選了各PLI 的核心活性序列，得到一個(gè)活性短肽，經(jīng)分子對(duì)接軟件處理預(yù)測(cè)該短肽正好鑲嵌于sPLA2 輸水通道中。據(jù)此我們?cè)O(shè)計(jì)并合成一個(gè)含有19 個(gè)氨基酸的模擬肽，其序列為PGLPLSLQNGGGGSVAFRS，并在分子水平及細(xì)胞水平驗(yàn)證了其抑制活性。通過(guò)上述生物信息學(xué)理論預(yù)測(cè)和有關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明蛇血清PLI 對(duì)人sPLA2 具有良好的抑制活性，有望開(kāi)發(fā)成為臨床抗花生四烯酸炎癥通路藥物。本研究設(shè)計(jì)合成的19aa PLI 模擬肽，為臨床小分子抗炎藥物開(kāi)發(fā)提供了新的思路。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本作品希望在自然界找到一種高特異性、低副作用抗炎藥物PLI。PLA2是炎癥通路總開(kāi)關(guān)，而蛇毒PLA2是毒蛇捕獵武器，蛇血清解毒蛋白PLI使其不懼毒液。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)蛇毒與人PLA2高度相似，說(shuō)明蛇血清PLI對(duì)人PLA2的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)從五步蛇毒中純化PLA2，以此為靶酶進(jìn)行PLI篩選，最終從華游蛇血清中純化到一種PLI。此外我們?cè)O(shè)計(jì)一個(gè)具有抑制活性的19肽，也成為特異性抗炎藥物另一突破點(diǎn)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 科學(xué)先進(jìn)性：1.PLA2是人體炎癥通路總開(kāi)關(guān)，PLI可有效抑制炎癥發(fā)生和繼發(fā)展；2.基于生物信息學(xué)，蛇和人PLA2結(jié)構(gòu)高度相似。為PLI用于抑制人PLA2提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證；3.PLI特異性的靶點(diǎn)，降低了其副作用；4.根據(jù)PLI序列設(shè)計(jì)的模擬肽，可解決蛋白藥物免疫原性缺點(diǎn)。獨(dú)特之處：根據(jù)“酶-抑制劑”關(guān)系，結(jié)合生物信息學(xué)篩選到天然特異性PLI及模擬肽序列，為后續(xù)藥物研究打下基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 1. PLI可以應(yīng)用到臨床各種急慢性炎癥預(yù)防和治療，例如急性胰腺炎，具有毒副作用小，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。2. PLA2廣泛存在各種蛇毒中，是主要毒素成分。因此，蛇血清PLI可以廣譜地治療蛇咬傷，即PLI可被開(kāi)發(fā)成廣譜型抗蛇傷藥物。相對(duì)抗蛇毒血清，PLI更安全、易保存，且不需辨認(rèn)為何種蛇咬傷，因此開(kāi)發(fā)價(jià)值較大。而抗蛇毒血清不易制備和保存，應(yīng)用時(shí)必須知道毒蛇種類，還具有免疫原性，這對(duì)偏遠(yuǎn)山區(qū)人們意義不大。
學(xué)術(shù)論文摘要
- PLA2是炎癥通路總開(kāi)關(guān)。PLA2的過(guò)度表達(dá)是多種炎癥性疾病的重要原因。目前臨床抗炎藥物副作用大。因此，尋找高效低副作用的PLA2抑制劑是亟待解決的問(wèn)題。蛇毒中PLA2含量最豐富，為其主要的毒性成分，而一些蛇血清中含有PLI能中和蛇毒PLA2。本文第一部分利用生物信息學(xué)，對(duì)人源和蛇源PLA2進(jìn)行了序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)人源和蛇源sPLA2一級(jí)結(jié)構(gòu)相似度為35%-49%，三級(jí)結(jié)構(gòu)相似度超過(guò)95%。隨后我們利用層析柱，從五步蛇蛇毒中分離得到sPLA2，活性測(cè)定其酶活性和出血毒性最強(qiáng)。以其為靶酶，對(duì)某省常見(jiàn)六種蛇血清進(jìn)行初篩，結(jié)果表明華游蛇抑制活性最高。通過(guò)Source 30Q、超濾、Uno Q從華游蛇血清中純化得到PLI，SDS-PAGE 表明該蛋白含有25.4Ku 和21.2Ku 兩個(gè)亞基，初步推測(cè)該蛋白為γ型PLI。并證明了其對(duì)于人GIIPLA2 的抑制活性。第三部分中，通過(guò)篩選各PLI的活性序列設(shè)計(jì)并合成一個(gè)19aa模擬肽，并驗(yàn)證了其抑制活性。上述生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)表明PLI對(duì)人PLA2 具有良好的抑制活性，有望開(kāi)發(fā)成為臨床抗炎藥物。模擬肽為臨床小分子抗炎藥物開(kāi)發(fā)提供了新的思路。
獲獎(jiǎng)情況
- 1.Priminary investigation to the clinical applicatioin of phospholipasae A2 inhibitor from serum[J].Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology,2010,107.(指導(dǎo)老師為通訊作者） 2.Snake venom C-type Lectin protein, agacuterin,inhibits platelet aggregation and carcinoma cell migration[J].Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 2010,107.(指導(dǎo)老師為通訊作者） 3.From global to individual: the discovery of a novel C-type lectin protein from five-pace snake venom[J].Cell Biology International,2010,34. 4.蛇毒C 型凝集素家族結(jié)構(gòu)及抗原表位預(yù)測(cè)[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2010,26:963. 5.蛇血清分泌型磷脂酶A2抑制劑防治人炎癥的生物信息學(xué)分析[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2011.（5月份接收，排版待刊登） 6.常見(jiàn)蛇血清中抗蛇毒sPLA2蛋白的篩選與純化[J].藥物生物技術(shù),2011.（5月份接收，排版待刊登）
鑒定結(jié)果
- 合格
參考文獻(xiàn)
- 1.黃松, 黃接棠.王錦蛇血清對(duì)尖吻蝮蛇毒的抑制作用[J].蛇志,2005,179:237. 2.胡愷, 萬(wàn)新華等.烏梢蛇血清對(duì)白眉蝮等3種蛇毒解毒作用初探[J].蛇志,2006,18:178. 3.Ichiro K, Makoto M.PLA2 enzymes[J].Prostaglandins & other Lipid Mediators,2002,68:3. 4.羅艷萍, 陳遠(yuǎn)志.短尾蝮蛇毒磷脂酶A2的分離純化及抗血小板聚集作用[J].蛇志,2009,21:90. 5.Xu S, Chen C,et al.Crucial role of groupⅡPLA2 in pancreatitis-associated adrenal injury in acute necrotizing pancreatitis[J].Pathology-Research and Practice,2010,206:73. 6.Maria EG, Ofelia CA,et al. Isolation and functional characterization of a new acidic PLA2 Ba-SpII-RP4 of the Bothrops alternatus snake venom[J].Toxicon,2010,56:64. 7.Kohshi K, Ryoichi S,et al.Up-regulation of the expressions of PLA2 inhibitors in the liver of a venomous snake by its own venom PLA2[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2010, 395:377. 8.周長(zhǎng)虹，梁寧生.磷脂酶A2抑制劑與相關(guān)疾病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2009,20:378. 9.Ryoichi S, Michihisa T,et al.Identi?cation and characterization of PLA2 inhibitors from the serum of the Japanese rat snake[J].Toxicon,2009,53:685.
同類課題研究水平概述
- 從蛇血清這一角度進(jìn)行的sPLA2 抑制劑研究，國(guó)內(nèi)外已有一些報(bào)道。國(guó)內(nèi)目前采用的方法還主要是單純的用某種蛇血清中和蛇毒的表觀實(shí)驗(yàn)法，發(fā)現(xiàn)了某種蛇血清有一定的中和療效，或者分離得到PLI，沒(méi)有深入研究。目前在國(guó)內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域研究中，黃松利用王錦蛇血清作用于尖吻蝮蛇蛇毒，發(fā)現(xiàn)王錦蛇血清對(duì)尖吻蝮蛇蛇毒引起的組織損傷及炎癥有抑制、保護(hù)和治療作用。國(guó)際上，Ikuo N 等利用融合蛋白技術(shù)對(duì)TfPLI 抑制Tf sPLA2 機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，失去完整N 端(1-37aa)的TfPLI 不具有活性。peter G 從 Naja ater 蛇血清從提取得到的NaPLI，對(duì)源于類風(fēng)濕病患者關(guān)節(jié)滑液中的sPLA2 具有較強(qiáng)抑制活性。這一發(fā)現(xiàn)提示，蛇血清PLI 可用于治療臨床上sPLA2 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Thwin 設(shè)計(jì)出2 種短肽，與sPLA2 的疏水通道結(jié)合發(fā)揮其抑制活性；Chandra 等人也合成2 種五肽LAIYS、 FLSYK，具有一定sPLA2 親和力?？偟膩?lái)說(shuō)，目前國(guó)內(nèi)已有的研究報(bào)道對(duì)于蛇血清中sPLA2 抑制劑運(yùn)用的技術(shù)較為單一，只是發(fā)現(xiàn)了某種蛇血清有一定的療效，對(duì)于具體的成分及活性沒(méi)有深入的研究；國(guó)際上，僅僅停留于PLI 的分離純化及活性檢測(cè)，而對(duì)于PLI 與sPLA2的具體作用機(jī)制研究的較少，獲得的成果亦不多。在國(guó)外，對(duì)于PLI 的研究已經(jīng)受到了科研機(jī)構(gòu)的重視，據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)在已經(jīng)從21 中蛇血清中分離得到PLI，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同分為α、β、γ 三類。本文相比較國(guó)內(nèi)外蛇血清PLI 的研究，有以下幾點(diǎn)進(jìn)展：1、綜合分析確定蛇毒中PLA2 為sPLA2,這對(duì)后續(xù)深入研究奠定了基礎(chǔ)；2、分離純化蛇血清蛋白得到了γ 型PLI，并將其作用于sPLA2；3、采用生物信息學(xué)方法，提取了PLI，并對(duì)其臨床應(yīng)用進(jìn)行了研究。蛇血清PLI 的分離純化及機(jī)制研究為高效低毒的抗蛇毒藥物研究提供了新的方向，同時(shí)也為特異性干預(yù)人sPLA2 炎性通路的臨床藥物的研究帶來(lái)了希望。本論文所設(shè)計(jì)思路及研究技術(shù)在蛇血清PLI 這一研究領(lǐng)域中，已處于較前沿，達(dá)到了“國(guó)內(nèi)領(lǐng)先，國(guó)際先進(jìn)”的水平。
