基本信息
- 項目名稱：
- c-myc、Livin基因的表達在內(nèi)毒素致肝細胞凋亡中的作用及CA的保護效應
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術(shù)論文
- 簡介：
- 內(nèi)毒素（ET)在革蘭氏陰性細菌感染發(fā)病機理中起著十分重要的作用。尾靜脈注射ET建立大鼠內(nèi)毒素血癥模型，并觀察多價陽離子A（CA）對其的保護效應，結(jié)果顯示ET組中各時間段的肝細胞凋亡指數(shù)一直上升，CA組的肝細胞凋亡及病理組織學改變較輕；ET可上調(diào)c-myc基因和下調(diào)Livin基因的表達，從而促進肝細胞凋亡，CA則能明顯下調(diào)c-myc基因和上調(diào)Livin基因的表達，從而抑制肝細胞凋亡。
- 詳細介紹：
- 本實驗采用流式細胞術(shù)、實時熒光定量RT-PCR和免疫組織化學技術(shù)研究內(nèi)毒素(ET)對大鼠肝臟c-myc、Livin基因的表達變化、肝細胞凋亡情況及陽離子A(CA)的保護效應。將72只清潔級SD大鼠隨機分為3組：第Ⅰ組為NS對照組(n=24)、第Ⅱ組為ET致病組(n=24)、第Ⅲ組為ET+CA保護組(n=24），三組動物經(jīng)相應處理后分別在3h、4h、8h、12h采集肝臟作為樣本。 本實驗通過大鼠注射ET后，經(jīng)PI染色和流式細胞儀檢測，結(jié)果表明對照組肝細胞的凋亡率在3h、4h、8h、12h時分別為2.45％、2.71％、3.28％、3.06％；ET組肝細胞凋亡率在3h、4h、8h、12h時分別為10.98％、14.75％、19.23％、24.13％，明顯高于各同時期對照組(P<0.01)，且隨著時間的增加而增加，這提示了ET能顯著促進肝細胞的凋亡。 c-myc基因作為一個參與細胞凋亡調(diào)控的主要基因，可激活誘導細胞凋亡通路。本研究實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，對照組和ET組均能檢測到熒光信號，方差分析結(jié)果表明ET組c-myc基因相對拷貝數(shù)極顯著高于對照組(P<0.01)。免疫組化結(jié)果顯示，在對照組和ET組均有c-myc基因的表達，t檢驗結(jié)果表明c-myc基因ET組在肝臟表達均明顯高于對照組(P<0.01)。由實驗結(jié)果可判斷，ET組肝臟c-myc基因的表達隨時間的增加一直呈上升趨勢。本研究結(jié)果顯示，ET可明顯誘導c-myc基因表達的上調(diào)，誘導細胞凋亡。 Livin是最近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族中的新成員，是一種作用很強的凋亡抑制因子。 本研究實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，對照組和ET組均能檢測到熒光信號，方差分析結(jié)果表明肝臟ET組Livin基因的相對拷貝數(shù)極顯著低于對照組(P<0.01)。免疫組化的研究結(jié)果顯示，在對照組和ET組均有Livin基因的表達，方差分析結(jié)果表明Livin基因在ET組肝臟表達均明顯低于對照組(P<0.01)。由此可以看出，ET組肝臟Livin基因的表達變化隨時間增加呈下降趨勢。本實驗結(jié)果顯示，ET能下調(diào)Livin基因的表達，使肝細胞凋亡加劇，這是造成肝細胞損傷的機制之一。 Rietschel認為干擾ET結(jié)構(gòu)或干擾含有ET結(jié)構(gòu)的膜的藥物都可以幫助殺死細菌。David等在對內(nèi)毒素拮抗的研究中發(fā)現(xiàn)帶正電荷的藥物是通過其所帶正電荷基因與內(nèi)毒素脂質(zhì)A上的磷酸基團結(jié)合，從而破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)及其生物活性。本實驗以CA作為多價陽離子拮抗劑進行內(nèi)毒素保護作用的研究，CA的保護效應表現(xiàn)在c-myc基因和Livin基因的表達變化上。本實驗中用實時熒光定量RT-PCR測定的結(jié)果顯示，CA保護組肝臟c-myc基因相對拷貝數(shù)在8h極顯著高于對照組(P<0.01)，3h、4h、12h顯著高于對照組(P<0.05)；3h顯著低于ET組(P<0.05)；4h、8h、12h極顯著低于ET組(P<0.01)。CA保護組肝臟Livin基因相對拷貝數(shù)在3h顯著低于對照組(P<0.05)，4h、8h、12h 極顯著低于對照組(P<0.01)；4h顯著高于ET組(P<0.05)，3h、8h、12h極顯著高于ET組(P<0.01)。免疫組化實驗結(jié)果表明，CA保護組c-myc基因表達蛋白3h、4h、8h、12h的積分光密度極顯著高于對照組(P<0.01)，極顯著低于ET組(P<0.01)。CA保護組Livin基因表達蛋白3h、4h、8h、12h的積分光密度極顯著低于對照組(P<0.01)，極顯著高于ET組(P<0.01)。由實驗結(jié)果可知，CA保護組肝臟c-myc基因的表達變化呈先上升后下降的趨勢，而Livin基因的表達變化則呈先下降后上升的趨勢。如前所述，c-myc是促凋亡基因，Livin是抗凋亡基因，因此，與ET組相比，CA保護組c-myc基因表達的降低和Livin基因表達的升高，必然使肝細胞凋亡受到抑制。其原因是CA下調(diào)c-myc基因的表達和上調(diào)Livin基因的表達抑制肝細胞的凋亡。通過以上實驗結(jié)果可以看出，CA對由ET誘導的肝臟損傷有明顯的保護效應，這為臨床防治內(nèi)毒素血癥和開發(fā)抗內(nèi)毒素藥物提供理論依據(jù)。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 為了探討內(nèi)毒素(ET)對肝細胞的損傷機制，本作品采用實時熒光定量RT-PCR、免疫組織化學技術(shù)、流式細胞術(shù)研究ET對大鼠肝臟c-myc、Livin基因的表達變化，肝細胞凋亡情況及陽離子A(CA)的保護效應。分別在3 h、4 h、8 h、12 h檢測各分組肝臟組織細胞凋亡情況、c-myc、Livin基因相對拷貝數(shù)及c-myc、Livin基因表達蛋白的積分光密度并觀察CA對上述指標的影響。
科學性、先進性及獨特之處
- 作品采用實時熒光定量RT-PCR、免疫組織化學技術(shù)、流式細胞術(shù)等現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，從分子和細胞水平揭示ET導致c-myc、Livin基因的表達差異變化，肝細胞調(diào)亡情況及陽離子A(CA)的保護效應，結(jié)果真實且可信度高，對于闡明ET的致病機制，防治內(nèi)毒素血癥具有積極的指導意義和臨床應用價值。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 陽離子A（CA）能夠上調(diào)肝臟Livin基因的表達和下調(diào)c-myc基因的表達，從而顯著地抑制肝細胞的凋亡，對內(nèi)毒素導致的組織和細胞的損傷有顯著的保護效應。在臨床上，為內(nèi)毒素(ET)引起的內(nèi)毒素血癥，在治療療效上達到療效確切、毒副作用小、價格低廉提供了一個較有前景的方向。
學術(shù)論文摘要
- 本試驗采用流式細胞術(shù)，實時熒光定量RT-PCR，免疫組織化學技術(shù)研究內(nèi)毒素(ET)對大鼠肝細胞凋亡情況、肝臟組織中c-myc、Livin基因的表達變化及陽離子A(CA)的保護效應。將72只大鼠隨機分為三組，第Ⅰ組為NS對照組(n=24)、第Ⅱ組為ET致病組(n=24)、第Ⅲ組為ET+CA保護組(n=24)，各組經(jīng)相應處理后分別在3 h、4 h、8 h、12 h檢測各組肝臟組織細胞凋亡情況、c-myc、Livin基因相對拷貝數(shù)及c-myc、Livin蛋白的積分光密度并觀察CA對上述指標的影響。結(jié)果顯示ET組中各時間段的肝組織中肝細胞凋亡指數(shù)一直上升，CA組的肝細胞凋亡及病理組織學改變較輕。在mRNA水平和蛋白水平上，ET組c-myc基因表達量增加但Livin基因表達量下降，而CA組的肝細胞凋亡數(shù)較ET組有所減少，c-myc基因表達量減少但Livin基因表達量上升。結(jié)論為ET可上調(diào)c-myc基因的表達和下調(diào)Livin基因的表達，從而促進肝細胞凋亡，最終導致肝細胞損傷。CA則能明顯下調(diào)c-myc基因的表達和上調(diào)Livin基因的表達，從而抑制肝細胞凋亡，對ET誘導的肝損傷具有保護效應。
獲獎情況
- 2011年4月獲得校級第九屆“挑戰(zhàn)杯”學生課外學術(shù)科技作品競賽一等獎 2011年5月獲得第六屆云南高校青年學術(shù)科技節(jié)自然科學類二等獎
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
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同類課題研究水平概述
- 盡管一個多世紀以來學者們對ET進行了深入廣泛的研究并取得了矚目的成績，但由于ET對機體系統(tǒng)、器官作用的廣泛性，至今對內(nèi)毒素血癥的發(fā)病機理仍不完全明確，國內(nèi)療效確切、毒副作用小、價格低廉的抗內(nèi)毒素血癥療法也很少。 一百多年來，雖然闡明了ET 的化學本質(zhì)結(jié)構(gòu)，深入研究了ET與機體的相互作用，對內(nèi)毒素性疾病尤其是內(nèi)毒素性休克的發(fā)生機理也有了許多深入廣泛的認識，但是由于內(nèi)毒素休克發(fā)生機理的復雜性，導致臨床上對內(nèi)毒素性休克及由此引起的多器官功能衰竭的治療效果依然不如人意，內(nèi)毒素休克的病死率仍居高不下。這說明內(nèi)毒素休克發(fā)生機理亟待更深入的研究。特別是研究凋亡在內(nèi)毒素體外介導細胞損傷的影響，有利于更深入全面的闡明內(nèi)毒素誘發(fā)的疾病機制。近年來，國內(nèi)主要從事ET致細胞凋亡方面的研究有：河北省醫(yī)學科學院藥物研究室的李麗萍等，對關(guān)于氨基胍在內(nèi)毒素性肺損傷中起何作用作了研究；復旦大學公共衛(wèi)生學院的周曉瑜等關(guān)于內(nèi)毒素在小鼠過敏性哮喘模型所起的作用進行了探討；浙江杭州市中醫(yī)院的鄭文龍等對慢性阻塞性肺疾病血瘀癥與內(nèi)毒素、內(nèi)皮素的關(guān)系進行了研究探討；華中科技大學同濟醫(yī)學院的祝偉等就己酮可可堿在內(nèi)毒素血癥大鼠模型中心肌HSP70和NF-κB表達中有何影響做了探討研究；華中科技大學同濟醫(yī)學院的李敬等采用脂多醣致小鼠死亡實驗研究板藍根的抗內(nèi)毒素作用。機體的細胞凋亡系統(tǒng)極其復雜，各調(diào)節(jié)凋亡基因更多的是通過不同的凋亡途徑來共同調(diào)節(jié)細胞的凋亡。c-myc和Livin是目前研究較為深入的兩種凋亡相關(guān)基因。近來發(fā)現(xiàn)c-myc基因與細胞凋亡有密切關(guān)系，實驗證明，c-myc與TNF誘導的凋亡過程可因Bcl-2蛋白的異位表達而受到限制，Bcl-2能阻止由c-myc基因引起的細胞凋亡，Bcl-2的相伴活動能取消c-myc對細胞凋亡的影響等等。但是內(nèi)毒素對肝臟細胞凋亡過程中c-myc基因和Livin基因的表達變化及它們之間相互作用影響對肝細胞凋亡有何表達變化，目前尚未弄清楚。
