基本信息
- 項目名稱：
- 微生物毒素AFB1誘導(dǎo)小鼠肝臟病變過程中相關(guān)蛋白功能研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 黃曲霉毒素(Aflatoxins)是黃曲霉(A．flavors)和寄生曲霉(A．parasiticus)等產(chǎn)毒菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,其中黃曲霉毒素B1是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的毒性和致癌性最強的天然污染物。
- 詳細介紹：
- 黃曲霉毒素(Aflatoxins)是黃曲霉(A．flavors)和寄生曲霉(A．parasiticus)等產(chǎn)毒菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,其中黃曲霉毒素B1是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的毒性和致癌性最強的天然污染物。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等多種實驗手段結(jié)合起來研究黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)表達的肝臟蛋白的功能。研究用黃曲霉毒素B1，處理小白鼠和細胞， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFB1不僅會造成小白鼠發(fā)病 ，也會造成細胞不同程度上的損傷。運用雙向電泳找出小鼠發(fā)病后肝臟的差異蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜分析得到蛋白的氨基酸序列，用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測其結(jié)構(gòu)及功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30個蛋白質(zhì)點變化差異顯著。分析其中7個明顯上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)點,其中有4個蛋白可能屬于引發(fā)小鼠肝臟發(fā)生病變或癌變的蛋白質(zhì)點，另外3個蛋白可能參與小鼠肝臟能量與物質(zhì)的代謝。結(jié)果表明，這些蛋白對小鼠肝臟都有著很大的影響 。 選取其中與腫瘤關(guān)系較大基因atp5b進行研究，利用熒光定量PCR技術(shù)分析atp5b在免疫小鼠肝臟中的動態(tài)變化情況，結(jié)果與雙向電泳的結(jié)果基本一致。為了進一步研究atp5b的細胞生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建過表達載體pCDNA3.1(-)-atp5b、RNA干擾載體pGPU6/GFP/neo-shRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中，G418篩選獲得穩(wěn)定表達細胞株。研究發(fā)現(xiàn)，AFB1處理會引起細胞中atp5b含量的降低；而在atp5b過表達的體系中，在缺氧條件下，細胞增殖率變小，生長緩慢；在atp5b干擾的細胞系中，MTT法檢測細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)設(shè)計的3個shRNA片段中shRNA1、shRNA2組細胞增殖率大于1，shRNA3組細胞增殖率小于1；干擾apt5b后細胞耐受AFB1的能力降低。本研究進一步驗證了atp5b對細胞生物學(xué)行為的影響，也將為闡明腫瘤細胞中ATP合成酶的功能提供了理論依據(jù)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 黃曲霉毒素，是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的毒性和致癌性最強的天然污染物。目前國內(nèi)外在黃曲霉毒素致毒機理方面的研究大都缺乏系統(tǒng)性，這對深入全面地了解黃曲霉毒素的毒理作用，對其誘發(fā)的腫瘤進行標本兼治很不利的。本研究通過比較正常和病理情況下蛋白質(zhì)在肝臟中表達差異，能夠同時發(fā)現(xiàn)與病理改變有關(guān)的一系列疾病特異性蛋白質(zhì)，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等多種實驗手段結(jié)合起來研究黃曲霉毒素誘導(dǎo)的小鼠肝臟相關(guān)蛋白的功能。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 本研究以昆明鼠作為模式動物，大大降低了試驗成本，同時結(jié)合多種試驗方法研究黃曲霉毒素誘導(dǎo)的小鼠肝臟蛋白的功能。將為今后生物毒素研究搭建了一個較理想的平臺 。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本研究從感染老鼠開始到定位特異蛋白在經(jīng)典發(fā)病途徑中的作用，是國內(nèi)外首次系統(tǒng)的對污染農(nóng)產(chǎn)品的黃曲霉毒素的致毒機理進行研究。 本研究將為系統(tǒng)地揭示黃曲霉毒素誘導(dǎo)疾病的發(fā)生機制鋪平道路，為完善疾病的發(fā)生通路提供有益信息，為疾病的診斷提供新的分子標記，同時為肝癌的治療和藥物開發(fā)提供了一些新的思路。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本研究用黃曲霉毒素B1，處理小白鼠和細胞，發(fā)現(xiàn)AFB1會造成小白鼠發(fā)病，同時會造成細胞不同程度上的損傷。然后運用雙向電泳找出小鼠發(fā)病后肝臟的差異蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜分析得到蛋白的氨基酸序列，用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測其結(jié)構(gòu)及功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)30個蛋白質(zhì)點變化差異顯著，分析其中7個明顯上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)點。其中有4個蛋白可能屬于引發(fā)小鼠肝臟發(fā)生病變或癌變的蛋白質(zhì)點，另外3個蛋白可能參與小鼠肝臟能量與物質(zhì)的代謝。這些蛋白對小鼠肝臟都有著莫大的影響。 本研究選取其中與腫瘤關(guān)系較大基因atp5b進行研究，先利用熒光定量PCR分析其在免疫小鼠肝臟中的動態(tài)變化情況，結(jié)果與雙向電泳的結(jié)果基本一致。然后構(gòu)建過表達載體和RNA干擾載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞中，用以研究atp5b的細胞生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)，AFB1處理會引起細胞中atp5b含量的降低；在atp5b過表達的體系中，缺氧條件下，細胞增殖率變小，生長緩慢；在atp5b干擾的細胞系中，MTT法檢測細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)設(shè)計的3個shRNA片段中shRNA1、shRNA2組細胞增殖率大于1，shRNA3組細胞增殖率小于1。本研究進一步驗證了atp5b對細胞生物學(xué)行為的影響，也將進一步闡明在腫瘤細胞中ATP合成酶的功能提供了條件。
獲獎情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- [1] 蘇建家, 李瑗, 班克臣, 等. 動態(tài)研究HBV和AFB1誘發(fā)樹鼩肝細胞癌過程中一些基因的表達[J]. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2001, 18(2): 15l-154. [2] J. Sambrook，E．F．Fritsch，T．Maniatis著．分子克隆實驗指南[M]．金冬雁，黎孟楓譯．第二版．北京：科學(xué)出版社，1996：19-55 [3]Okazaki S, Naganuma A, Kuge S. Peroxiredoxin-mediated redox regulation of the nuclear localization of Yap1 a transcription factor in budding yeast. Antioxid Redox Signal, 2005, 7 (324):327-333
同類課題研究水平概述
- 在天然污染的糧食中以黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大，量也最多，致癌性也最強，它屬于肝臟毒素，能誘發(fā)肝癌。雖然AFB1的致癌機制由于缺乏直接的證據(jù)而一直不能充分肯定，但是許多相關(guān)研究表明黃曲霉毒素，特別是AFB1于肝癌的發(fā)生確實有莫大的關(guān)系。研究顯示，AFB1進入體內(nèi)后由于具有親肝性首先在肝細胞內(nèi)聚積，隨后在細胞色素P450系統(tǒng)作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?,9-環(huán)氧AFB1 (AFB1-8,9-epoxide，AFBO)，催化這一代謝的關(guān)鍵酶為細胞色素P450，該酶正好主要存在于肝細胞內(nèi)。在P450 3A4作用下的形成exo-AFBO為人類所知的具有基因毒性和致癌性的AFB1代謝產(chǎn)物。AFB1的基因毒性之一是誘發(fā)DNA損傷和導(dǎo)致基因突變。AFBO能和DNA分子共價結(jié)合形成AFB1-DNA，這一加合物的形成是其發(fā)揮基因毒性的關(guān)鍵步驟。目前關(guān)于黃曲霉毒素致癌的分子機制已經(jīng)有了一個大概的輪廓，但在其致癌過程中所涉及的具體效應(yīng)分子還不是很清楚。秦雪等人用雙向電泳等技術(shù)建立樹鼩肝癌實驗?zāi)Ｐ?，并對PrxⅡ蛋白的差異表達進行了驗證，證實該蛋白在肝癌組織中的蛋白表達及基因表達水平均較癌前組織明顯上調(diào)。Domenico C等在其研究中應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測到骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)高度表達于多種惡性腫瘤細胞質(zhì)，其表達與這些腫瘤的病理分級存在密切聯(lián)系表明，OPN在腫瘤演進中發(fā)揮了重要作用。肝癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多基因參與的病理過程其機制錯綜復(fù)雜，如何評價某種蛋白在該病理過程中所起的作用還需進一步驗證。
