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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 丹參酮高產(chǎn)的丹參發(fā)根生物反應(yīng)器的研制
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 丹參酮是臨床治療心、腦血管疾病的重要藥物資源。本作品將丹參酮代謝途徑中的關(guān)鍵代謝酶基因HMGR，DXS及GGPPS分別單獨(dú)或同時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化丹參獲得發(fā)根。結(jié)果顯示，在丹參毛狀根中過量表達(dá)SmDXS，SmHMGR，SmGGPPS基因顯著提高丹參酮產(chǎn)量，且SmHMGR和SmGGPPS組合可以產(chǎn)生協(xié)同作用。本研究為利用代謝工程策略大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)丹參酮提供了新思路。
- 詳細(xì)介紹：
- 心腦血管疾病是當(dāng)今世界上威脅人類健康的“頭號(hào)殺手”。 丹參 (Salvia miltiorriza) 為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，其主要成分包括脂溶性的丹參酮化合物；而丹參酮是臨床治療心、腦血管疾病的重要藥物資源，最近的研究還表明丹參酮具有抗癌作用，因此，丹參在臨床上具有廣泛的應(yīng)用。然而，丹參可用資源有限及有效成分含量低使之應(yīng)用受限。丹參毛狀根具有生長速度快，不需外源激素及遺傳性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，為生產(chǎn)丹參酮類活性物質(zhì)提供了一種良好的培養(yǎng)系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，一些生物及非生物誘導(dǎo)子也可以刺激丹參酮合成途徑中一些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)從而提高丹參酮的產(chǎn)量。而隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，采用代謝工程策略將丹參酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)氲降⒅?，獲得轉(zhuǎn)基因的發(fā)根，并進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，被認(rèn)為是提高丹參藥用活性成分的含量和解決丹參藥源問題的最佳途徑之一。 在本作品中，我們將丹參酮代謝途徑中的關(guān)鍵代謝酶基因HMGR，DXS及GGPPS的cDNA序列分別單獨(dú)或同時(shí)構(gòu)建于植物表達(dá)載體pCAMBIA1304+上的CaMV 35S啟動(dòng)子之后，以發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法遺傳轉(zhuǎn)化丹參外植體中獲得發(fā)根并使轉(zhuǎn)入基因在毛狀根中過量表達(dá)。結(jié)果顯示，在H系列（單獨(dú)轉(zhuǎn)化SmHMGR基因）的丹參毛狀根中，其丹參酮產(chǎn)量顯著提高。但是在G系列（單獨(dú)轉(zhuǎn)化SmHMGR基因）的丹參毛狀根中，其丹參酮的產(chǎn)量比H系列的丹參毛狀根更高。說明在丹參中，GGPPS比HMGR對于丹參酮合成的促進(jìn)作用更加明顯，可能是由于GGPPS比HMGR在丹參酮的代謝途徑中更位于下游所致。然而，在HG系列（同時(shí)過量表達(dá)SmHMGR及SmHMGR）的丹參毛狀根中發(fā)現(xiàn)一個(gè)丹參酮產(chǎn)量最高的株系，HG9。其丹參酮的產(chǎn)量達(dá)到了2.727 mg/g DW，比對照組丹參毛狀根（0.475 mg/g DW）的丹參酮產(chǎn)量高4.7倍。在本研究中發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA的含量與其丹參毛狀根的形態(tài)有關(guān)，凡是在本研究中丹參酮ⅡA的含量超過0.206mg/g, DW的丹參毛狀根都要比丹參酮ⅡA含量較低的丹參毛狀根要粗。DPPH自由基清除率試驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根的總抗氧化活性提高。本研究為利用代謝工程策略大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)丹參酮提供了新思路。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 研究目的：利用基因工程技術(shù)將丹參酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因?qū)氲降⒅?，研制獲得丹參酮高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根系，為應(yīng)用生物技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)丹參酮類活性成分提供一條新途徑。研究思路：將丹參酮生物合成關(guān)鍵酶基因SmDXS，SmHMGR和SmGGPPS分別單獨(dú)及組合構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，遺傳轉(zhuǎn)化丹參外植體并獲得丹參發(fā)根，通過分子檢測和含量篩選最終成功獲得丹參酮含量明顯提高的丹參發(fā)根株系。創(chuàng)新點(diǎn)：國際上首次利用基因共轉(zhuǎn)化策略將SmHMGR和SmGGPPS同時(shí)導(dǎo)入丹參發(fā)根中，成功篩選獲得丹參酮產(chǎn)量提高最為顯著的發(fā)根株系HG9，是丹參酮代謝工程研究的一大突破。技術(shù)關(guān)鍵： 1）植物高效表達(dá)載體的構(gòu)建； 2) 丹參酮高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根的篩選。主要技術(shù)指標(biāo)： 1）國際上首次利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)證明了過量表達(dá)SmDXS能夠顯著提高丹參發(fā)根中丹參酮的含量,表明DXP途徑在丹參酮代謝合成過程占主導(dǎo)作用;同時(shí)發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)SmHMGR能夠顯著提高丹參酮含量, 表明MVA途徑在二萜丹參酮代謝合成過程也具有重要作用; 2）國際上首次利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)證明了過量表達(dá)SmGGPPS能夠顯著提高丹參發(fā)根中丹參酮的含量, 暗示GGPPS是調(diào)控丹參酮代謝合成的新關(guān)鍵靶點(diǎn); 3）國際上首次利用基因共轉(zhuǎn)化策略將SmHMGR和SmGGPPS同時(shí)導(dǎo)入丹參發(fā)根中，結(jié)果獲得了丹參酮產(chǎn)量提高最為顯著的株系, 說明SmHMGR和SmGGPPS相組合則可以產(chǎn)生協(xié)同作用。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 作品的科學(xué)性： 丹參酮作為臨床心腦血管疾病治療常用中藥資源，組合利用基因工程和發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)研制獲得丹參酮高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根系，對于丹參品質(zhì)改良、應(yīng)用范圍拓展和解決資源不足等均具有重要意義，同時(shí)也為其他中藥材的遺傳育種和提高活性物質(zhì)的研究提供可借鑒的研究思路。因而該研究具有重要的科學(xué)意義和廣闊的應(yīng)用前景。作品的先進(jìn)性：這些優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的丹參發(fā)根藥材原料提供給制藥企業(yè)生產(chǎn)相關(guān)藥品, 將帶來更為巨大的經(jīng)濟(jì)效益; 通過提供高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藥源在較大程度上降低丹參酮生產(chǎn)成本，使其成為更多的臨床患者所使用，會(huì)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益；利用轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根取代丹參野生資源等作為丹參酮的藥源，可以在很大程度上遏制對天然野生資源的毀滅性采挖，從而有利于環(huán)境保護(hù)，并帶來巨大的生態(tài)效益；該研究有助于提高我國中草藥研究的科技含量，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，拉動(dòng)中藥材產(chǎn)業(yè)升級，因而該研究具有潛在的應(yīng)用前景。同時(shí)，本項(xiàng)目的實(shí)施也為其他名貴中藥材的保護(hù)和開發(fā)利用提供可借鑒的研究思路。
獲獎(jiǎng)情況及鑒定結(jié)果
- 本作品于2010年9月10日，在第四屆上海市植物生理學(xué)青年學(xué)術(shù)會(huì)議中，經(jīng)專家評審鑒定后榮獲“優(yōu)秀墻報(bào)獎(jiǎng)”；2010年10月16日，在上海市遺傳學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)暨上海遺傳學(xué)青年論壇中榮獲“復(fù)星醫(yī)藥遺傳學(xué)未來星杯”展板獎(jiǎng)。另外，該作品的部分結(jié)果已撰寫成SCI論文并發(fā)表在國際著名雜志Metabolic engineering(IF=4.725)上，本項(xiàng)目組還申請了和本作品相關(guān)的專利5項(xiàng)： 1)***，**，**，**，**。雙關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)化提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法. 中國專利申請?zhí)枺?01010264203.3 2)***，**，**，**，**。轉(zhuǎn)SmGGPPS基因提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法。中國專利申請?zhí)枺?01010263570.1 3)***，***，**, ***, **，***。SmDXS和SmGGPPS雙基因共轉(zhuǎn)化提高丹參酮含量的方法。中國專利申請?zhí)枺?01110034229.3 4)***，**，**，**，**。丹參1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因II及其編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。中國專利申請?zhí)枺?00910045446.5 5)***，**，**，***，***。一種提高水稻種子γ-氨基丁酸含量的方法。中國專利申請?zhí)枺?01010263299.1
作品所處階段
- 中試階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 無
作品可展示的形式
- 實(shí)物，現(xiàn)場演示，圖片
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測
- 1.使用說明 按照常規(guī)的恒溫?fù)u床或生物發(fā)酵罐等裝置在一定溫度條件下（25℃）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根的液體大量培養(yǎng)，2個(gè)月左右（期間更換新鮮培養(yǎng)液1次）即可獲得大批量的丹參酮高產(chǎn)的丹參發(fā)根。 2.技術(shù)特點(diǎn)本研究獲得的丹參發(fā)根具有如下特點(diǎn)：1）生長速度快；2）品質(zhì)穩(wěn)定性好；3）培養(yǎng)時(shí)不需添加外源激素；4）便于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；5）不受時(shí)間和季節(jié)的限制。 3. 適應(yīng)范圍，推廣前景的技術(shù)性說明及市場分析和經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測這些優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的丹參發(fā)根藥材原料提供給制藥企業(yè)生產(chǎn)相關(guān)藥品, 將帶來更為巨大的經(jīng)濟(jì)效益; 通過提供高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藥源在較大程度上降低丹參酮生產(chǎn)成本，使其為更多的臨床患者所使用，會(huì)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益；利用轉(zhuǎn)基因丹參發(fā)根取代丹參野生資源等作為丹參酮的藥源，可以在很大程度上遏制對天然野生資源的毀滅性采挖，從而有利于環(huán)境保護(hù)，并帶來巨大的生態(tài)效益；該研究有助于提高我國中草藥研究的科技含量，推動(dòng)中藥現(xiàn)代化和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，拉動(dòng)中藥材產(chǎn)業(yè)升級，因而該研究具有潛在的應(yīng)用前景。
同類課題研究水平概述
- 心、腦血管疾病是威脅人類健康與生命的“頭號(hào)殺手”。丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)是臨床治療心、腦血管疾病的常用中藥(滕艷芬等，2001；郭寶林等，2002；晏瓊等，2006)。丹參有效成分主要包括脂溶性丹參酮類成分和水溶性酚酸類成分，其中丹參酮在抗氧化、消炎抑菌及抗腫瘤等方面具有顯著療效，市場需求十分巨大 (梁勇等，2000；Yasuhiro，1997；Kim et al，2003；Gao et al，2008)。不過，野生丹參資源日益減少，栽培丹參品質(zhì)嚴(yán)重退化、生長周期長及有效成分含量低等原因，致使有限丹參資源與丹參酮巨大市場需求之間供需矛盾日益凸顯（郭寶林等，2002；晏瓊等，2006；周偉等，2007A)。利用代謝工程策略將關(guān)鍵代謝酶基因遺傳轉(zhuǎn)化植物體可以使其相關(guān)代謝產(chǎn)物有效提高（Mu?oz-Bertomeu et al., 2008；Kai et al., 2009）。因此，利用基因工程技術(shù)將丹參酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因（和/或調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子）導(dǎo)入到丹參中，獲得轉(zhuǎn)基因的毛狀根系或再生植株，是從根本上提高丹參中丹參酮含量和改良其藥材品質(zhì)的最佳途徑之一。目前國內(nèi)、外有關(guān)丹參主要活性成分之一丹參酮的研究主要集中在藥理作用、植化分析和毛狀根培養(yǎng)等方面(張蔭麟等，1995；邱德有等，2004)，國內(nèi)外尚未見到任何將關(guān)鍵酶基因?qū)氲⒅姓{(diào)控丹參酮代謝合成的研究報(bào)道。 從2006年起，申請人所在實(shí)驗(yàn)室開始在丹參酮代謝工程方面開展了大量的前期工作，建立優(yōu)化了丹參毛狀根誘導(dǎo)及葉片再生兩種遺傳轉(zhuǎn)化體系（周偉等2007B），分離克隆了丹參酮產(chǎn)量相關(guān)基因HMGS，HMGR，DXS，DXR和GGPPS等（Liao et al，2009；Yan et al，2009；Kai et al，2010）。 本研究將丹參酮生物合成的關(guān)鍵限速酶基因HMGR，DXS，GGPPS及HMGR+GGPPS組合轉(zhuǎn)入丹參，進(jìn)而考察對次生代謝途徑和代謝物產(chǎn)量的影響，最終獲得丹參酮含量較原植株明顯提高且表達(dá)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因丹參株系，具有重要的科學(xué)意義和廣闊的應(yīng)用前景。
