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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 血管內(nèi)皮生長因子VEGF165類似物的制備及活性評(píng)價(jià)
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 本課題是構(gòu)建帶有VEGF165定點(diǎn)突變基因的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒以及人血清白蛋白VEGF165融合蛋白質(zhì)粒，并研究其在畢赤酵母中的表達(dá)及其工藝條件的優(yōu)化，以獲得高產(chǎn)穩(wěn)定且具有生物學(xué)活性的VEGF165突變體和人血清白蛋白VEGF165融合蛋白，進(jìn)而對(duì)其蛋白活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
- 詳細(xì)介紹：
- 血管內(nèi)皮生長因子165(VEGF165)是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族中促血管生成活性最強(qiáng)的功能性蛋白，它通過與特異性受體VEGFR-1和VEGFR-2結(jié)合，發(fā)揮生理功能。VEGF165存在易降解，半衰期較短，天然來源較少等問題。有研究報(bào)道表明，在血漿中，VEGF165降解的主要位點(diǎn)為110位、111位，將蛋白藥物與人血清白蛋白融合也是提高藥物半衰期的常用辦法。 本課題從基因水平改造著手，并以畢赤酵母為表達(dá)系統(tǒng)，以期獲得量大且穩(wěn)定性較高的具有VEGF165活性的蛋白。本課題的目的是構(gòu)建帶有VEGF165定點(diǎn)突變（編碼110位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?11位丙氨酸突變?yōu)楦彼幔┗虻漠叧嘟湍副磉_(dá)質(zhì)粒以及人血清白蛋白VEGF165融合蛋白質(zhì)粒，并研究其在畢赤酵母中的表達(dá)及其工藝條件的優(yōu)化，以獲得高產(chǎn)穩(wěn)定且具有生物學(xué)活性的VEGF165突變體和人血清白蛋白VEGF165融合蛋白。 VEGF165突變體采用的方法為用重疊延伸PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，利用酶切連接的方法將突變后的VEGF165基因片段構(gòu)建入表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k；同時(shí)構(gòu)建VEGF165與人血清白蛋白融合表達(dá)質(zhì)粒，兩者分別在畢赤酵母GS115中表達(dá)。 利用Heparin-Sepharose CL6B親和層析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化，并以人血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC）為細(xì)胞株評(píng)價(jià)其生物學(xué)活性。 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為SDS-PAGE蛋白電泳分析及Western blot顯示突變后的VEGF165可在酵母中高效表達(dá)，并以可溶性分子的形式存在于上清液中；生物學(xué)活性檢測結(jié)果顯示突變后的VEGF165具有刺激人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論是突變后的VEGF165基因可在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行高效分泌性表達(dá)，其產(chǎn)物具有刺激人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。突變后的VEGF165與野生型的VEGF165相比，穩(wěn)定性是否能被提高，還有待進(jìn)一步研究。VEGF165融合白蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建完畢，待進(jìn)一步研究。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 目的和基本思路： 1、VEGF165生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析 根據(jù)VEGF165的結(jié)構(gòu)特征和已被解析的酶解位點(diǎn)的工作積累，采用生物信息學(xué)方法，從基因水平設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變位點(diǎn)，并結(jié)合白蛋白融合技術(shù)設(shè)計(jì)高活性、穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)的血管內(nèi)皮生長因子VEGF165類似物。 2、新的VEGF165類似物的制備根據(jù)已設(shè)計(jì)的具有高活性和穩(wěn)定的VEGF165類似物的結(jié)構(gòu)特征，采用定點(diǎn)突變的手段改造易被纖溶酶降解的部位，構(gòu)建突變的VEGF165表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)其在畢赤酵母中分泌表達(dá)和制備。初步建立其與白蛋白修飾的融合蛋白，實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中分泌表達(dá)。 3、VEGF165類似物的活性評(píng)價(jià)采用細(xì)胞生物學(xué)手段，結(jié)合功能分析，評(píng)價(jià)VEGF165類似物對(duì)血管形成細(xì)胞增殖的影響。 創(chuàng)新點(diǎn)： 1、結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)的工作積累和生物信息學(xué)的分析結(jié)果，提出了高活性和穩(wěn)定的VEGF165類似物的新設(shè)計(jì)思路。 2、采用定點(diǎn)突變技術(shù)改造了VEGF165易被纖溶酶降解的位點(diǎn)，利用白蛋白融合技術(shù)制備了長效的VEGF165，獲得了高效穩(wěn)定的VEGF165類似物，在方法上有所創(chuàng)新。 技術(shù)關(guān)鍵： 1、定點(diǎn)突變技術(shù)。 2、白蛋白融合表達(dá)技術(shù)。 主要技術(shù)指標(biāo)： 1、發(fā)酵產(chǎn)率：≥200mg/L 2、純化得率：≥20%，純度：≥85% 3、活性
科學(xué)性、先進(jìn)性
- VEGF165在血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、相關(guān)科學(xué)研究有著廣泛的應(yīng)用，并且在傷口愈合及冠心病的治療上顯示了廣闊的前景。VEGF165在體內(nèi)的半衰期較短（約為90分鐘），容易受到體內(nèi)纖溶酶和其他蛋白酶的作用而降解，構(gòu)建和制備高效穩(wěn)定的VEGF165類似物有其明確的應(yīng)用價(jià)值。針對(duì)VEGF165的缺陷，項(xiàng)目通過對(duì)VEGF165的結(jié)構(gòu)特征分析，設(shè)計(jì)了高活性且穩(wěn)定的VEGF165類似物，實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中分泌表達(dá)和制備。結(jié)合白蛋白融合技術(shù)，有望獲得高度穩(wěn)定的VEGF165類似物。上述二種VEGF165類似物查新未見報(bào)道。
獲獎(jiǎng)情況及鑒定結(jié)果
- 項(xiàng)目目標(biāo)產(chǎn)品VEGF165類似物經(jīng)過與無錫瑞融生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行合作，已經(jīng)在無錫、蘇州多所科研院所和生物技術(shù)公司試用，反映良好。
作品所處階段
- 中試階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 生產(chǎn)工藝及工程菌
作品可展示的形式
- 圖片和樣品
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測
- 使用說明：技術(shù)轉(zhuǎn)讓，已于2010年10月1日與無錫瑞融生物醫(yī)藥有限公司合作開發(fā)。 技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢：采用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，設(shè)計(jì)和制備的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的VEGF165類似物，與市場同類產(chǎn)品比較，具有高活性和穩(wěn)定的特征，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)和血管生物學(xué)的研究，市場前景廣闊。 適用范圍：科研院所及生物技術(shù)公司 推廣前景：項(xiàng)目設(shè)計(jì)和制備的VEGF165類似物具有高活性和穩(wěn)定的特征，明顯優(yōu)于同類產(chǎn)品，且制備成本低廉，有著很強(qiáng)的競爭優(yōu)勢。可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)和血管生物學(xué)的研究，并有望開發(fā)成心腦血管疾病的治療藥物及創(chuàng)傷恢復(fù)外用制劑，市場前景廣闊。 經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測：目前該類產(chǎn)品在細(xì)胞培養(yǎng)和血管生物學(xué)研究的市場目前大約在2億美元，傷口愈合及冠心病藥物市場在200億美元以上。VEGF165經(jīng)這兩種技術(shù)改進(jìn)，獲得穩(wěn)定性好和高活性的VEGF165類似物因其產(chǎn)品的優(yōu)勢特征，將在試劑市場和進(jìn)一步的藥物開發(fā)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
同類課題研究水平概述
- 一、制備方面 目前，國內(nèi)對(duì)于VEGF165制備的實(shí)驗(yàn)室的研究較多和產(chǎn)品開發(fā)較多，但對(duì)VEGF165的衍生產(chǎn)品大多對(duì)其表達(dá)方面進(jìn)行研究，而成品化的研究則較少，國內(nèi)應(yīng)用的血管內(nèi)皮生長因子均來源于國外。國外制備情況較國內(nèi)較好，但是也未見有關(guān)VEGF165生產(chǎn)工藝的研究報(bào)道。VEGF165主要存在天然來源少、半衰期短，穩(wěn)定性差等問題。 二、藥理學(xué)研究方面 VEGF165在藥理學(xué)方面的基礎(chǔ)研究相對(duì)與它的制備較廣泛，國內(nèi)外均有大量的報(bào)道，通過VEGF165與其受體的作用方面等研究VEGF165基本功能以及出現(xiàn)的新的功能。國內(nèi)外主要從體外給予重組蛋白VEGF165或者以VEGF165基因轉(zhuǎn)染的方式對(duì)其藥理學(xué)進(jìn)行研究，具體如下：基因轉(zhuǎn)染方法研究VEGF165功能，如MENG Qing-you等利用VEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞中，再移植到患有慢性靜脈血栓的老鼠中，VEGF165基因表達(dá)VEGF165蛋白，重通毛細(xì)管，從而改善該疾病。但是臨床研究表示基因轉(zhuǎn)染不能夠達(dá)到預(yù)期治療的效果。含有VEGF165的復(fù)合生物材料修復(fù)骨缺損，來促進(jìn)局部血管生成，增加缺損區(qū)血供，為促進(jìn)骨組織修復(fù)奠定基礎(chǔ)。如CAO Kai等人利用此方法修復(fù)兔子的以VEGF165及其受體作為血管抑制劑的靶點(diǎn)，抗血管治療從而達(dá)到抑制腫瘤的生長和繁殖，最終導(dǎo)致死亡。如Robert S. Kerbel探究抗血管治療腫瘤的機(jī)制，提出了幾種殺死腫瘤的機(jī)制，這種方法具有很強(qiáng)的特異性，而對(duì)正常的細(xì)胞無毒性，有很好的治療腫瘤的療效。針對(duì)VEGF165蛋白不穩(wěn)定，半衰期短的缺點(diǎn)，目前也有報(bào)道通過不同載體介導(dǎo)VEGF165蛋白進(jìn)入人體，改善其缺點(diǎn)，從而達(dá)到治療的效果。如J. Kastrup等人利用微粒狀載體運(yùn)載VEGF165蛋白，在特定的部位釋放，從而達(dá)到治療心肌缺血病的效果。 VEGF及其受體作為靶點(diǎn)治療腫瘤也是目前研究的熱點(diǎn)，如Esther Raskopf等利用siRNA特異性地作用于VEGF，在基因水平抑制VEGF的表達(dá)，對(duì)肝癌的治療有很好的效果。本課題能顯著延長VEGF165半衰期的突變體VEGF165和HSA-VEGF165融合蛋白等VEGF165類似物在臨床上具有廣闊的前景。
