基本信息
- 項目名稱：
- 血管內(nèi)皮生長因子VEGF165類似物的制備及活性評價
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 本課題是構建帶有VEGF165定點突變基因的畢赤酵母表達質粒以及人血清白蛋白VEGF165融合蛋白質粒，并研究其在畢赤酵母中的表達及其工藝條件的優(yōu)化，以獲得高產(chǎn)穩(wěn)定且具有生物學活性的VEGF165突變體和人血清白蛋白VEGF165融合蛋白，進而對其蛋白活性進行評價。
- 詳細介紹：
- 血管內(nèi)皮生長因子165(VEGF165)是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族中促血管生成活性最強的功能性蛋白，它通過與特異性受體VEGFR-1和VEGFR-2結合，發(fā)揮生理功能。VEGF165存在易降解，半衰期較短，天然來源較少等問題。有研究報道表明，在血漿中，VEGF165降解的主要位點為110位、111位，將蛋白藥物與人血清白蛋白融合也是提高藥物半衰期的常用辦法。 本課題從基因水平改造著手，并以畢赤酵母為表達系統(tǒng)，以期獲得量大且穩(wěn)定性較高的具有VEGF165活性的蛋白。本課題的目的是構建帶有VEGF165定點突變（編碼110位精氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?11位丙氨酸突變?yōu)楦彼幔┗虻漠叧嘟湍副磉_質粒以及人血清白蛋白VEGF165融合蛋白質粒，并研究其在畢赤酵母中的表達及其工藝條件的優(yōu)化，以獲得高產(chǎn)穩(wěn)定且具有生物學活性的VEGF165突變體和人血清白蛋白VEGF165融合蛋白。 VEGF165突變體采用的方法為用重疊延伸PCR定點突變技術，利用酶切連接的方法將突變后的VEGF165基因片段構建入表達質粒pPIC9k；同時構建VEGF165與人血清白蛋白融合表達質粒，兩者分別在畢赤酵母GS115中表達。 利用Heparin-Sepharose CL6B親和層析對表達產(chǎn)物進行初步純化，并以人血管內(nèi)皮細胞（HMEC）為細胞株評價其生物學活性。 實驗的結果為SDS-PAGE蛋白電泳分析及Western blot顯示突變后的VEGF165可在酵母中高效表達，并以可溶性分子的形式存在于上清液中；生物學活性檢測結果顯示突變后的VEGF165具有刺激人血管內(nèi)皮細胞增殖的活性。 本實驗的結論是突變后的VEGF165基因可在畢赤酵母表達系統(tǒng)中進行高效分泌性表達，其產(chǎn)物具有刺激人血管內(nèi)皮細胞增殖的生物學活性。突變后的VEGF165與野生型的VEGF165相比，穩(wěn)定性是否能被提高，還有待進一步研究。VEGF165融合白蛋白表達質粒構建完畢，待進一步研究。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術關鍵和主要技術指標
- 目的和基本思路： 1、VEGF165生物信息學和結構生物學分析 根據(jù)VEGF165的結構特征和已被解析的酶解位點的工作積累，采用生物信息學方法，從基因水平設計定點突變位點，并結合白蛋白融合技術設計高活性、穩(wěn)定和經(jīng)濟的血管內(nèi)皮生長因子VEGF165類似物。 2、新的VEGF165類似物的制備根據(jù)已設計的具有高活性和穩(wěn)定的VEGF165類似物的結構特征，采用定點突變的手段改造易被纖溶酶降解的部位，構建突變的VEGF165表達系統(tǒng)，實現(xiàn)其在畢赤酵母中分泌表達和制備。初步建立其與白蛋白修飾的融合蛋白，實現(xiàn)了在畢赤酵母中分泌表達。 3、VEGF165類似物的活性評價采用細胞生物學手段，結合功能分析，評價VEGF165類似物對血管形成細胞增殖的影響。 創(chuàng)新點： 1、結合結構生物學的工作積累和生物信息學的分析結果，提出了高活性和穩(wěn)定的VEGF165類似物的新設計思路。 2、采用定點突變技術改造了VEGF165易被纖溶酶降解的位點，利用白蛋白融合技術制備了長效的VEGF165，獲得了高效穩(wěn)定的VEGF165類似物，在方法上有所創(chuàng)新。 技術關鍵： 1、定點突變技術。 2、白蛋白融合表達技術。 主要技術指標： 1、發(fā)酵產(chǎn)率：≥200mg/L 2、純化得率：≥20%，純度：≥85% 3、活性
科學性、先進性
- VEGF165在血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)、相關科學研究有著廣泛的應用，并且在傷口愈合及冠心病的治療上顯示了廣闊的前景。VEGF165在體內(nèi)的半衰期較短（約為90分鐘），容易受到體內(nèi)纖溶酶和其他蛋白酶的作用而降解，構建和制備高效穩(wěn)定的VEGF165類似物有其明確的應用價值。針對VEGF165的缺陷，項目通過對VEGF165的結構特征分析，設計了高活性且穩(wěn)定的VEGF165類似物，實現(xiàn)了在畢赤酵母中分泌表達和制備。結合白蛋白融合技術，有望獲得高度穩(wěn)定的VEGF165類似物。上述二種VEGF165類似物查新未見報道。
獲獎情況及鑒定結果
- 項目目標產(chǎn)品VEGF165類似物經(jīng)過與無錫瑞融生物醫(yī)藥有限公司進行合作，已經(jīng)在無錫、蘇州多所科研院所和生物技術公司試用，反映良好。
作品所處階段
- 中試階段
技術轉讓方式
- 生產(chǎn)工藝及工程菌
作品可展示的形式
- 圖片和樣品
使用說明,技術特點和優(yōu)勢,適應范圍,推廣前景的技術性說明,市場分析,經(jīng)濟效益預測
- 使用說明：技術轉讓，已于2010年10月1日與無錫瑞融生物醫(yī)藥有限公司合作開發(fā)。 技術特點和優(yōu)勢：采用生物信息學和分子生物學技術，設計和制備的具有自主知識產(chǎn)權的VEGF165類似物，與市場同類產(chǎn)品比較，具有高活性和穩(wěn)定的特征，可廣泛應用于細胞培養(yǎng)和血管生物學的研究，市場前景廣闊。 適用范圍：科研院所及生物技術公司 推廣前景：項目設計和制備的VEGF165類似物具有高活性和穩(wěn)定的特征，明顯優(yōu)于同類產(chǎn)品，且制備成本低廉，有著很強的競爭優(yōu)勢?？蓮V泛應用于細胞培養(yǎng)和血管生物學的研究，并有望開發(fā)成心腦血管疾病的治療藥物及創(chuàng)傷恢復外用制劑，市場前景廣闊。 經(jīng)濟效益預測：目前該類產(chǎn)品在細胞培養(yǎng)和血管生物學研究的市場目前大約在2億美元，傷口愈合及冠心病藥物市場在200億美元以上。VEGF165經(jīng)這兩種技術改進，獲得穩(wěn)定性好和高活性的VEGF165類似物因其產(chǎn)品的優(yōu)勢特征，將在試劑市場和進一步的藥物開發(fā)領域得到廣泛的應用。
同類課題研究水平概述
- 一、制備方面 目前，國內(nèi)對于VEGF165制備的實驗室的研究較多和產(chǎn)品開發(fā)較多，但對VEGF165的衍生產(chǎn)品大多對其表達方面進行研究，而成品化的研究則較少，國內(nèi)應用的血管內(nèi)皮生長因子均來源于國外。國外制備情況較國內(nèi)較好，但是也未見有關VEGF165生產(chǎn)工藝的研究報道。VEGF165主要存在天然來源少、半衰期短，穩(wěn)定性差等問題。 二、藥理學研究方面 VEGF165在藥理學方面的基礎研究相對與它的制備較廣泛，國內(nèi)外均有大量的報道，通過VEGF165與其受體的作用方面等研究VEGF165基本功能以及出現(xiàn)的新的功能。國內(nèi)外主要從體外給予重組蛋白VEGF165或者以VEGF165基因轉染的方式對其藥理學進行研究，具體如下：基因轉染方法研究VEGF165功能，如MENG Qing-you等利用VEGF165基因轉染內(nèi)皮細胞中，再移植到患有慢性靜脈血栓的老鼠中，VEGF165基因表達VEGF165蛋白，重通毛細管，從而改善該疾病。但是臨床研究表示基因轉染不能夠達到預期治療的效果。含有VEGF165的復合生物材料修復骨缺損，來促進局部血管生成，增加缺損區(qū)血供，為促進骨組織修復奠定基礎。如CAO Kai等人利用此方法修復兔子的以VEGF165及其受體作為血管抑制劑的靶點，抗血管治療從而達到抑制腫瘤的生長和繁殖，最終導致死亡。如Robert S. Kerbel探究抗血管治療腫瘤的機制，提出了幾種殺死腫瘤的機制，這種方法具有很強的特異性，而對正常的細胞無毒性，有很好的治療腫瘤的療效。針對VEGF165蛋白不穩(wěn)定，半衰期短的缺點，目前也有報道通過不同載體介導VEGF165蛋白進入人體，改善其缺點，從而達到治療的效果。如J. Kastrup等人利用微粒狀載體運載VEGF165蛋白，在特定的部位釋放，從而達到治療心肌缺血病的效果。 VEGF及其受體作為靶點治療腫瘤也是目前研究的熱點，如Esther Raskopf等利用siRNA特異性地作用于VEGF，在基因水平抑制VEGF的表達，對肝癌的治療有很好的效果。本課題能顯著延長VEGF165半衰期的突變體VEGF165和HSA-VEGF165融合蛋白等VEGF165類似物在臨床上具有廣闊的前景。
