基本信息
- 項目名稱：
- 白紋伊蚊高效Bt的篩選及細胞受體蛋白分析
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 率先從白玉蘭葉片上分離獲得了多株Bt野生菌株，篩選獲得對白紋伊蚊有高效活性的LLP29菌株。經分子生物學鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株的主要殺蚊基因為cyt1基因，國際分類命名委員會將其命名為cyt1Aa6新基因，擁有自主知識產權。經對白紋伊蚊受體蛋白分析，發(fā)現(xiàn)Cyt1Aa6毒素蛋白主要結合于白紋伊蚊中腸上，且該毒素蛋白與C6/36細胞特異結合。
- 詳細介紹：
- 蚊蟲是“四害”之首，不僅刺叮騷擾，而且能傳播多種疾病，如登革熱、黃熱病、瘧疾、乙型腦炎等，嚴重危害人體健康。白紋伊蚊在我國從南向北至沈陽，西北至隴縣、寶雞，西南至西藏都有分布，是我國重要的媒介蚊蟲，可傳播登革和西尼羅等多種蟲媒病毒，而當前的醫(yī)療水平還不能根治登革熱或西尼羅熱等急性蟲媒傳染病，也尚無有效的疫苗，行之有效的措施只有集中在對其傳播媒介-白紋伊蚊的控制上。因此，白紋伊蚊的有效防治是預防和控制登革熱和西尼羅熱的根本。近年來由于存在抗藥性、環(huán)境污染以及破壞生態(tài)平衡等問題，化學殺蟲劑的應用受到環(huán)境保護組織和社會的巨大壓力。生物防治由于不污染環(huán)境、特異性較高、對非靶標生物影響小以及不容易產生抗性等優(yōu)點，被認為是較為理想的防治手段之一。當今，衛(wèi)生害蟲的生物防治日漸受到醫(yī)學昆蟲界和世界衛(wèi)生組織（WHO）等有關機構的重視，其中令人矚目的是利用昆蟲病原細菌防治蚊蟲方面的研究應用。目前發(fā)現(xiàn)和篩選用于生物防治蚊蟲的昆蟲病原細菌大多集中于蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）和球形芽胞桿菌 (B. sphaericus，簡稱 Bs)。 Bt是一種革蘭氏染色正反應（G+）細菌，主要特性在于形成芽孢的同時在菌體內形成具有蛋白質性質的一個或多個伴胞晶體，又稱殺蟲晶體蛋白或δ-內毒素。由于這類蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目昆蟲及動植物寄生線蟲等有較強的毒殺作用，而對人和家畜無毒、不污染環(huán)境、不產生抗藥性等優(yōu)點，在全球農、林、衛(wèi)生害蟲防治中得到廣泛應用。Bt的殺蟲晶體蛋白由cry基因和cyt基因編碼，這些基因大多位于染色體外的質粒上。Bt殺蟲活性與ICPs的形狀、結構和大小均有著密切關系。Bt以色列亞種主要含有Cry4、Cry10、Cry11、Cyt1 和 Cyt2等毒素蛋白，對多種蚊蟲有高效活性，已成功開發(fā)為生物殺蟲劑用于蚊蟲和蚋等多種雙翅目昆蟲的防治，在瘧疾、登革熱、黃熱病和絲蟲病等蚊媒疾病的控制上發(fā)揮了重要的作用。不同蚊種，甚至同一蚊種不同地理株由于其易感性、受體、靶標位點等存在差異，同時，不同Bt菌株由于本身也存在殺蟲活性、殺蟲蛋白、作用基因、與受體結合能力和種類等差異，至今還沒有Bt對蚊蟲作用機理的詳盡描述。目前國內外學者研究熱點主要集中于毒素蛋白與受體的結合上，這在一定程度上為Bt對蚊蟲作用機理的詮釋提供了理論依據(jù)。白紋伊蚊與登革病毒Ⅱ型中腸感染屏障機理的形成及中腸胰蛋白酶的作用、圍食膜的形成均有關。受體決定了蚊蟲及組織對病毒的感染特性，因為在埃及伊蚊的中腸上鑒定到受體，而在非登革媒介淡色庫蚊中腸上鑒定不到病毒受體。劉美德等也在C6/36細胞上發(fā)現(xiàn)登革病毒受體蛋白的存在。楊發(fā)青等發(fā)現(xiàn)蚊蟲中腸感染屏障受感染病毒劑量的影響。與鱗翅目昆蟲一致，蚊蟲攝食Bt殺蟲劑的ICPs，ICPs在中腸堿性條件下二硫鍵打開，在腸道胰蛋白酶的作用下激活形成抗蛋白酶的毒性核心片斷后才有活性。Bt活性蛋白與中腸上皮細胞結合后，有毒性的α-螺旋穿透細胞膜形成一個離子通道（孔），依pH不同，這些孔具有選擇性（僅K+可通過）和非選擇性（Na+和陰離子可通過），由于堿性中腸和蛋白酶的作用，因而這些孔很有可能有K+滲漏，這種陰離子通道破壞了膜電勢，細胞膨脹并裂解，導致中腸壞死，圍食膜和上皮退化變性，腸壁受損后，中腸的堿性高滲內含物進入血腔，血淋巴pH升高而導致昆蟲麻痹死亡。因此，盡管在不同水平上對ICPs的作用機制已有所了解，但仍缺乏更精確的信息。隨著ICPs結構與功能研究的不斷深入，必將不斷豐富和完善ICPs分子作用機制，為進一步在分子水平上利用基因操作及蛋白質工程技術開發(fā)這一潛在有廣闊應用前景的微生物殺蚊劑奠定基礎。微生物資源的開發(fā)、收集和利用是當今世界各國備受關注的熱點，許多國家都將其作為產業(yè)競爭的一個重要因素，保護和有效利用Bt資源對加速我國微生物農藥的產業(yè)化進程，提高微生物藥物產業(yè)在國際市場的競爭力十分必要。然而，關于Bt的生態(tài)學意義至今尚未明確，對于Bt是土壤的寄居菌還是葉片的腐生菌也還未能準確描述。白玉蘭（Magnolia denudata），俗稱“應春花”、“望春花”，在中國有2500年左右的栽培歷史，分布于中國中部及西南地區(qū)，為庭園中名貴的觀賞樹?，F(xiàn)世界各地均已引種栽培。除了觀賞價值，白玉蘭不但能作為重要的香精原料，還可作為分離Bt的重要材料。因此，本研究擬從白玉蘭葉片中篩選高效殺蚊Bt菌，以白紋伊蚊為對象進行研究，旨在獲得高效的Bt殺蚊菌株，明確其殺蚊主效因子，從而詮釋殺蚊蛋白對白紋伊蚊的作用機制，為保護和有效利用微生物資源、發(fā)展我國生物型衛(wèi)生殺蟲劑及有效預防和控制由白紋伊蚊等媒介蚊蟲傳播的蟲媒傳染病提供重要的理論和應用價值。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：獲得高效殺蚊Bt菌株，探索其作用機理，為有效控制白紋伊蚊提供重要的理論依據(jù)?；舅悸罚阂园子裉m為材料進行Bt菌株分離，以白紋伊蚊昆蟲及細胞為靶標進行高效菌株篩選，以昆蟲學、分子生物學、細胞生物學、免疫學等技術進行殺蚊機理研究。
科學性、先進性及獨特之處
- 1、材料創(chuàng)新：選擇中國有特色的植物進行高效Bt菌株篩選； 2、新基因：鑒定經國際認可并擁有自主知識產權的基因。可以提供于實際應用。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 1、分離得到的LLP29菌株對白紋伊蚊有毒殺作用，比目前國內常用的菌株提高毒力12.74%； 2、新基因可以提供用于工程菌構建。
學術論文摘要
- 率先從白玉蘭葉片上分離獲得了多株蘇云金芽孢桿菌（Bt）野生菌株，篩選獲得對白紋伊蚊有高效活性的LLP29菌株。經PCR鑒定，該菌株的主要殺蚊基因為cyt1基因，國際分類命名委員會將其命名為cyt1Aa6新基因。通過形態(tài)學、基因型、蛋白等研究表明，純化的Cyt1Aa6毒素蛋白對白紋伊蚊幼蟲及其細胞系C6/36細胞都有高效活性，LC50為0.33 μg/mg，IC50為0.025 μg/mg。以白紋伊蚊敏感品系及C6/36細胞進行受體結合試驗，免疫組織化學結果表明，Cyt1Aa6毒素蛋白主要結合于中腸上，免疫熒光結合試驗顯示該毒素蛋白與C6/36細胞為陽性結合。
獲獎情況
- 1、Lingling Zhang, Enjiong Huang, Ivan Gelbi, Chunyu Guan, Yi Guan & Xiong Guan. 2009. Cloning, expression and characterisation of a promising mosquitocidal gene. Indian Journal of Experimental Biology, 47：799-803 2、Lingling Zhang, Enjiong Huang, Jing Lin, Ivan Gelbic, Qunlin Zhang, Yi Guan, Tianpei Huang, Xiong Guan. 2010. A novel Mosquitocidal Bacillus thuringiensis Strain LLP29 Isolated from the Phylloplane of Magnolia denudate. Microbiological Research，165：133-141
鑒定結果
- 分離的細菌經過形態(tài)學、生理生化、分子生物學鑒定為Bt菌株，所含殺蚊基因為cyt1Aa6基因。
參考文獻
- 1、Costechareyre D., Dridi B., Rahbé Y., Condemine G. (2010) Cyt toxin expression reveals an inverse regulation of insect and plant virulence factors of Dickeya dadantii. Environ Microbiol. 12(12):3290-301. 2、Fernandez-Luna M.T., Lanz-Mendoza H., Gill S.S., Bravo A., Soberon M., Miranda-Rios J. (2010) An alpha-amylase is a novel receptor for Bacillus thuringiensis ssp. israelensis Cry4Ba and Cry11Aa toxins in the malaria vector mosquito Anopheles albimanus (Diptera: Culicidae). Environ Microbiol. 12(3):746-757. 3、Perez C, Fernandez L E, Sun J, et al. Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cyt1Aa synergizes Cry11Aa toxin by functioning as a membrane-bound receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2005, 102 (51): 18303-18308.
同類課題研究水平概述
- 國際上多家單位開展相關研究，如University of Califormnia、Université Joseph Fourier (France)、Institut de Recherche Pour le Développement (France)、Universidad Nacional Autónoma de México (Mexico)、University of British Columbia (Canada)、National Institute of Malaria Research (India)、Instituto de Biologia do Exército (Brazil)、University of Alexandria (Egypt)等，國內的華中農業(yè)大學和中科院武漢病毒所也開展了關于蚊蟲生防的研究，但由于不同蚊種，甚至同一蚊種不同地理株由于其易感性、受體、靶標位點等存在差異，同時，不同Bt菌株由于本身也存在殺蟲活性、殺蟲蛋白、作用基因、與受體結合能力和種類等差異，至今還沒有Bt對蚊蟲作用機理的詳盡描述,特別是在細胞生物學水平上進行深入解釋。
