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基本信息
- 項(xiàng)目名稱(chēng)：
- 新型丙型肝炎病毒定量PCR檢測(cè)試劑盒的研制
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”作品
- 小類(lèi)：
- 生命科學(xué)
- 大類(lèi)：
- 科技發(fā)明制作A類(lèi)
- 簡(jiǎn)介：
- 我們?cè)O(shè)計(jì)了一類(lèi)新型二聚體突變引物，實(shí)現(xiàn)的探針的單標(biāo)記，克服了Taqman探針技術(shù)成本高、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。采用該技術(shù)進(jìn)行了丙型HCV定量檢測(cè)，并進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)以及與Taqman探針技術(shù)進(jìn)行了方法對(duì)比，數(shù)據(jù)顯示本試劑盒的檢測(cè)性能達(dá)到了現(xiàn)今同類(lèi)產(chǎn)品的水平，在檢測(cè)成本和檢測(cè)時(shí)間上有明顯優(yōu)勢(shì)。
- 詳細(xì)介紹：
- 我們研發(fā)了一類(lèi)新型二聚體熒光突變引物，將熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在引物上，而淬滅基團(tuán)標(biāo)記在與熒光引物互補(bǔ)的寡核苷酸鏈上，即兩條互補(bǔ)的寡核苷酸只分別標(biāo)記了相應(yīng)的淬滅或者報(bào)告基團(tuán)。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可巧妙地回避對(duì)淬滅鏈末端進(jìn)行封閉，因?yàn)樗m與引物互補(bǔ)，而3’端已被淬滅基團(tuán)阻斷，而PCR不能從5’端延伸，所以不需要對(duì)5’端進(jìn)行磷酸化阻斷；而引物僅5’端標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)，引物與靶基因結(jié)合后，可從3’端延伸完成靶基因復(fù)制。這樣，實(shí)現(xiàn)了真正的單標(biāo)記結(jié)構(gòu)，故合成、純化簡(jiǎn)單且成本低，克服了普通多標(biāo)記探針?lè)ǔ杀靖叩碾y題。此外，為達(dá)到根據(jù)real-time PCR原理，準(zhǔn)確定量的目的，我們?cè)诤蜔晒庖锘パa(bǔ)的淬滅鏈序列中，人為設(shè)計(jì)一個(gè)堿基突變。無(wú)靶基因時(shí)，兩者將相互結(jié)合產(chǎn)生FRET，不會(huì)發(fā)射熒光。一旦標(biāo)本中存在靶基因，由于熒光引物與靶基因完全互補(bǔ)，而淬滅鏈存在1個(gè)突變堿基，所以在較高溫度下，熒光引物與靶基因的親和力大于與淬滅鏈間的親和力，從而優(yōu)先和靶基因結(jié)合，在PCR體系中發(fā)揮普通引物引導(dǎo)延伸的功能，標(biāo)記的熒光基團(tuán)隨引物整合在新生PCR產(chǎn)物中起探針的指示作用，即所有新生PCR產(chǎn)物均被熒光基團(tuán)標(biāo)記。此時(shí)，F(xiàn)RET被破壞，忠實(shí)反映PCR產(chǎn)物量的熒光信號(hào)可被實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。根據(jù)上述分析，從理論上說(shuō)應(yīng)用我們建立的這一檢測(cè)系統(tǒng)，根據(jù)擴(kuò)增時(shí)熒光信號(hào)的增加，可準(zhǔn)確進(jìn)行基因定量。并且，由于引物具有高度特異性，產(chǎn)生的熒光信號(hào)也是高度特異的，既具備探針?lè)ǖ奶禺愋?，而又不用單?dú)設(shè)計(jì)熒光標(biāo)記的探針，同時(shí)又具有染料法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)。目前熒光定量PCR儀已在醫(yī)院廣泛應(yīng)用，該系統(tǒng)可直接在臨床檢驗(yàn)中推廣應(yīng)用。因此，新型二聚體熒光突變引物具有精確定量、標(biāo)記簡(jiǎn)單、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，符合臨床檢測(cè)方法要求的可靠、實(shí)用兩大原則，將其開(kāi)發(fā)成高通用性，易于推廣普及的核酸定量技術(shù)，可在感染性疾病、腫瘤、遺傳疾病、基因表達(dá)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在感染性疾病的臨床檢測(cè)中，定量PCR技術(shù)多用于一些臨床培養(yǎng)難以開(kāi)展或者培養(yǎng)周期較長(zhǎng)的病原體，如：各種病毒、結(jié)核分枝桿菌、支原體、沙眼衣原體等，也有用于耐藥基因檢測(cè)的報(bào)道。本研究中，我們擬選擇HCV為研究對(duì)象，通過(guò)與其它臨床檢測(cè)方法比較和方法學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)基于新型二聚體突變引物的熒光定量PCR技術(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)評(píng)價(jià)，證實(shí)其可行性，并探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。
作品專(zhuān)業(yè)信息
設(shè)計(jì)、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 熒光定量PCR的定量技術(shù)多種多樣，主要分為熒光染料技術(shù)和熒光探針技術(shù)。熒光染料技術(shù)特異性不高，熒光探針技術(shù)雖然特異性好，但是常用的Taqman探針技術(shù)主要存在兩大問(wèn)題：一是在探針的兩端標(biāo)記兩個(gè)熒光基團(tuán)，標(biāo)記和純化難度高；二是Taqman探針的發(fā)光需要Taq酶的水解作用，對(duì)Taq酶的要求高，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。我們研發(fā)了一類(lèi)新型二聚體熒光突變引物，將熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記在引物上，而淬滅基團(tuán)標(biāo)記在與熒光引物互補(bǔ)的寡核苷酸鏈上，即兩條寡核苷酸只分別標(biāo)記了相應(yīng)的淬滅或者報(bào)告基團(tuán)。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)巧妙地回避了對(duì)淬滅鏈末端進(jìn)行封閉，因?yàn)樗m與引物互補(bǔ)，而3’端已被淬滅基團(tuán)阻斷，而PCR不能從5’端延伸，所以不需要對(duì)5’端進(jìn)行磷酸化阻斷；5’端標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)的引物與靶基因結(jié)合后，可從3’端延伸完成復(fù)制。并且應(yīng)用到丙型肝炎病毒（HCV）定量檢測(cè)中。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 本項(xiàng)目以熒光共振能量轉(zhuǎn)移為理論基礎(chǔ)，基于該基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的各種探針技術(shù)，在科研和臨床診斷中已廣泛應(yīng)用，從理論講，本項(xiàng)目設(shè)計(jì)思想是可行的。首次提出新型二聚體熒光突變引物，以及基于此建立新型real-time PCR系統(tǒng)的科學(xué)設(shè)想。其既有探針?lè)ㄌ禺愋愿叩膬?yōu)點(diǎn)，又克服了其設(shè)計(jì)復(fù)雜、合成成本高的難題，為real-time PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)提供了新思路和新方法。本項(xiàng)目不僅學(xué)術(shù)思想創(chuàng)新性強(qiáng)、密切結(jié)合臨床需求，具有較高的科學(xué)性和社會(huì)價(jià)值，而且可直接轉(zhuǎn)化開(kāi)發(fā)，生產(chǎn)具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的商品化試劑盒，打破國(guó)外壟斷，創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益。
獲獎(jiǎng)情況及鑒定結(jié)果
- 2011年5月，海南省大學(xué)生“挑戰(zhàn)杯”決賽二等獎(jiǎng)。
作品所處階段
- 臨床初步試用檢測(cè)階段。
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 整體有償轉(zhuǎn)讓。
作品可展示的形式
- 可在墻報(bào)或以論文形式展示。
使用說(shuō)明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì),適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說(shuō)明,市場(chǎng)分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測(cè)
- 1.結(jié)構(gòu)上具有天然的“熱啟動(dòng)”功能，增加了方法的特異性； 2.熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離近，報(bào)告基團(tuán)可被有效抑制，降低了方法的本底，一旦擴(kuò)增開(kāi)始兩者便徹底分離，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)，增加了方法的靈敏度； 3.真正實(shí)現(xiàn)熒光探針的單標(biāo)記，降低了合成、純化難度，因此降低了成本。 4.二聚體突變引物可采用快循環(huán)，根據(jù)PCR速度最快，而不影響熒光曲線(xiàn)的原則選擇循環(huán)參數(shù)。 5.具有高通用性，可在國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口定量PCR儀上使用。 可用于所有核酸定量檢測(cè)，可在腫瘤、遺傳疾病、感染性疾病、基因表達(dá)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。與目前市場(chǎng)上廣泛使用的TaMan技術(shù)相比具有成本低、檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)，可產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益。
同類(lèi)課題研究水平概述
- 實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)分為內(nèi)摻式染料技術(shù)和探針技術(shù)兩類(lèi)。內(nèi)摻式染料技術(shù)方法簡(jiǎn)單，成本較低，但特異性差，故不適于臨床檢測(cè)。探針技術(shù)采用了基于熒光淬滅原理或熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）的探針，包括TaqMan探針、Amplifluor探針、分子信標(biāo)、蝎型探針等。這些探針均是在與模板互補(bǔ)的同一寡核苷酸鏈上，分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，特異性高，定量準(zhǔn)確，因而被廣泛應(yīng)用于臨床診斷中。但這些探針均屬于多標(biāo)記探針，其合成難度和成本較高，制約了其推廣應(yīng)用。不少研究人員試圖采用單標(biāo)記探針來(lái)降低合成難度和成本，如雜交探針（hybridization probes）和熒光置換探針（displacing probes），取得了較好效果。但為防止探針與靶序列雜交引起自身延伸而被破壞，仍然需要在探針末端磷酸化來(lái)阻斷其延伸，因此，并非真正意義的單標(biāo)記探針技術(shù)。基于上述分析，本課題設(shè)計(jì)了一種全新的二聚體突變引物，其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，為真正意義的單標(biāo)記探針。與其它多標(biāo)記熒光探針相比，二聚體突變引物有以下優(yōu)點(diǎn)： 1. 結(jié)構(gòu)上具有天然的“熱啟動(dòng)”功能，增加了方法的特異性； 2. 熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離近，報(bào)告基團(tuán)可被有效抑制，降低了方法的本底，一旦擴(kuò)增開(kāi)始兩者便徹底分離，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)，增加了方法的靈敏度； 3. 真正實(shí)現(xiàn)熒光探針的單標(biāo)記，降低了合成、純化難度，因此降低了成本。這種新型定量檢測(cè)系統(tǒng)既具有染料法對(duì)新生雙鏈DNA均能示蹤、成本低的特點(diǎn)，又具有探針?lè)ǜ咛禺愋裕且环N高通用性、高特異性和靈敏性、操作簡(jiǎn)單、價(jià)廉的新型real-time PCR技術(shù)。
