基本信息
- 項目名稱：
- C型肉毒梭菌的分離及肉毒毒素的制備、鑒定
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 肉毒梭菌廣泛存在于土壤中，對動物尸體旁土壤采用熱處理方法，找出對新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性的單菌落，染色后鏡檢選出疑似菌，經(jīng)生化鑒定確定為C型肉毒梭菌。提取肉毒素后，用蛋白電泳鑒定C型肉毒毒素的重鏈和輕鏈的大小分別為98.0KDɑ和53KDɑ，與理論分子量相符。將脫毒后的C型肉毒毒素與弗氏佐劑乳化后免疫家兔，并收集家兔血清。用抗毒素進行瓊擴和蛋白印跡實驗，檢測抗體效價和肉毒素的抗原性。
- 詳細介紹：
- 我們從塔里木大學校園內動物尸體旁20-40cm取土壤樣品，分別采用熱處理、50%酒精處理以及熱處理和50%酒精混合處理三種方法對樣品進行處理，取200ul的處理樣勻漿置于1%葡萄糖皰肉液體培養(yǎng)基中對樣品進行富集培養(yǎng)。取富集液倍比稀釋，涂平板36℃厭氧培養(yǎng)24h，選出單菌落。將單菌落分別依次涂于新霉素、卡那霉素、多粘菌素平板上，找出對新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性的單菌落，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢選出疑似菌，通過肉毒梭菌對不同糖醇及明膠和七葉苷的分解代謝進行生化鑒定得到C型肉毒梭菌。將鑒定后的C型肉毒梭菌至于pH 7.2-7.4的1%葡萄糖皰肉培養(yǎng)基36℃進行厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)3-5天，用飽和硫酸銨分離毒素。將分離的毒素置于透析袋中純化并濃縮肉毒毒素，采用SDS-PAGE電泳鑒定C型肉毒毒素的重鏈和輕鏈的大小分別為為98.0KDɑ和53.2KDɑ，與理論分子量相符。用65℃ 30min將C型肉毒毒素進行脫毒處理，將脫毒后的C型肉毒毒素與弗氏佐劑乳化后制成免疫佐劑，對家兔進行免疫，免疫結束后收集家兔血清。用抗毒素進行瓊脂擴散實驗和Western blotting實驗，檢測抗體效價和肉毒素的抗原性。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 肉毒毒素是一種強烈的神經(jīng)毒素。根據(jù)抗原性不同，分為A~G型。C型肉毒素是種高分子蛋白質毒素，兩個亞單位由二硫鍵連接成雙鏈分子。為確切了解和評價C型肉毒素的特點，我們分離鑒定C型肉毒梭菌和肉毒毒素，為進一步的應用奠定基礎，也為其他研究者提供理論依據(jù)，有助于深入研究肉毒梭菌及毒素。先分離鑒定C型肉毒梭菌；再提取純化C型肉毒毒素；最后制備C型肉毒毒素的抗毒素。研究C型肉毒素的抗原性，為后續(xù)研究奠定基礎。
科學性、先進性及獨特之處
- 實驗設計合理，立項依據(jù)充分，實驗方法正確，結論真實可信，結果可為研究者提供參考。隨著各型肉毒毒素的生物特性、藥理作用方面研究的不斷深入，肉毒毒素將得到更廣泛的應用。通過對肉毒素修飾改造，使毒素應用范圍更加擴大，應用研究有良好的前景，相信將來對毒素研究與應用會有更大的突破性進展。此外，對于A型肉毒毒素的研究非常透徹，而對于C型肉毒素研究較少，因而我們開展了此項研究，為深入研究C型肉毒素提供理論依據(jù)。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 肉毒毒素微量就可致病甚至致死。現(xiàn)如今人們生活中越來越多的食用豆制品以及火腿等食物，在包裝、衛(wèi)生等條件不達標的情況下非常容易導致食物中產(chǎn)生肉毒梭菌及肉毒毒素，對人們的生活有極大的影響。研究C型肉毒梭菌肉毒素，可以用來制備生物毒素防治蟲鼠害，生物抗衰老作用的發(fā)現(xiàn)也成為另一個重要原因，同時對肉毒素及抗毒素的制備，可以緊急治療肉毒中毒，也可用于檢測食品中的肉毒素，為食品的安全提供一定的保障。
學術論文摘要
- 肉毒梭狀芽孢桿菌廣泛的存在于土壤、發(fā)酵食物、肉類罐頭食品中。采集動物尸體旁土壤、水產(chǎn)市場排水道土壤，通過對土壤分別采用熱處理、50%酒精處理及熱處理和50%酒精混合處理三種方法進行分離肉毒梭菌，最終在動物尸體旁土壤中分離到抗逆細菌。通過比對三種處理方法，得出用50%酒精的處理方法的處理效果最好。通過肉毒梭菌對新霉素、卡那霉素、多粘菌素具有抗性這一特性對已分離的細菌進行選擇培養(yǎng)進一步分選，找出對這三種抗生素具有抗性的單菌落。革蘭氏染色鏡檢選出疑似菌，經(jīng)生化鑒定確定為C型肉毒梭菌。肉毒毒素是肉毒梭菌產(chǎn)生的一種神經(jīng)毒素，能夠通過抑制神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿釋放而引起肌肉麻痹。肉毒毒素在培養(yǎng)液中以復合物形式存在，其中的毒性組分由3個非同源性結構域組成，是一種新型的金屬蛋白酶。不同血清型的肉毒毒素能夠特異性地作用于不同底物，這些底物在神經(jīng)細胞的胞外分泌過程中發(fā)揮重要作用。對提取的C型肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒素進行滅活處理后通過SDS-PAGE進行濃度測定，確定濃度后給家兔進行免疫，免疫結束后心臟采血分離血清。用抗毒素進行瓊脂擴散實驗和Western blotting實驗，檢測抗體效價和肉毒素的抗原性。
獲獎情況
- 1、獲得“塔里木大學動物科學學院第二屆學術交流會優(yōu)秀論文三等獎”； 2、在2010年中國微生物學會學術年會上發(fā)表論文《肉毒梭菌的研究現(xiàn)狀及應用》
鑒定結果
- 分離出C型肉毒梭菌，掌握C型肉毒梭菌培養(yǎng)條件并提取肉毒素，用蛋白印跡技術鑒定出肉毒素重、輕鏈大小約為98KDɑ和53KDɑ。用瓊擴檢測抗體效價為1:8，蛋白印跡技術檢測肉毒素抗原性。
參考文獻
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同類課題研究水平概述
- 肉毒梭菌是一種腐物寄生菌。肉毒梭菌在自然界分布廣泛，土壤中?？蓹z出，江、河、湖、海沉積物，水果，蔬菜，畜、禽、魚等制品中亦可發(fā)現(xiàn)， 霉干草和畜禽糞便中均存在。早在18世紀末以前，在歐洲，尤其是在德國就已被人們所認識，由于那時候引起中毒的食品主要是臘腸，所以這種中毒就取自臘腸的拉丁文Botulus，而稱為臘腸中毒。在我國過去的一些書中，把本病譯為臘腸中毒，把肉毒梭菌譯為臘腸(毒)桿菌或臘腸(毒)梭菌。引起肉毒中毒主要是食入含有肉毒毒素的食品。這些食品是在調制加工、運輸貯存的過程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在適宜條件下，發(fā)芽、增殖并產(chǎn)生毒素所造成的。在國外，引起肉毒中毒的食品多為肉類及各種魚、肉制品、火腿，以及豆類、蔬菜和水果罐頭。中毒食品種類往往與飲食習慣有關：歐洲各國主要的中毒食品為火腿，臘腸和其他肉類等。美國主要是家庭制的水果罐頭，而火腿、臘腸等加工食品僅占7．7％。蘇聯(lián)和日本魚制品中毒最多，尤其是日本，幾乎全是魚制品的E型中毒。我國也有肉毒中毒的報導，肉類食品及罐頭食品引起的中毒的較少，據(jù)新疆肉毒科研協(xié)作組的223起肉毒中毒的調查統(tǒng)計，臭豆腐、豆鼓、面醬、紅豆腐、爛土豆等植物性食品共204起，占91．48％；其余的19起(占8．52％)是動物性食品，包括熟羊肉、羊油、豬油、臭雞蛋、臭魚、咸魚，臘肉、干牛肉、馬肉等。目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7個菌型。引起人中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F(xiàn)型只見報導發(fā)生在個別地區(qū)，如丹麥和美國各一起。1980年從瑞士五名突然死亡病例中發(fā)現(xiàn)G型毒素。肉毒梭菌產(chǎn)生的是一種神經(jīng)毒素，是目前已知的化學毒物與生物毒素中毒性最強烈的一種，對人的致死量為9-10mg／Kg，其毒力比氰化鉀還大一萬倍。肉毒梭菌在自然界的分布上具有區(qū)域性差異。A、B型的分布最廣，其廣泛分布于自然界，各大洲的許多國家均有檢出，研究較多；C、D型一般多存在于動物的尸體中或腐尸附近的土壤中，研究較少；E型多存在于海洋的沉積物、水產(chǎn)品的腸道內；F型適應于深水的低溫。越來越多的調查結果表明，除G型菌之外，其它各型菌的分布都是相當廣泛的。為了確切了解和評價C型肉毒素的特點，研究C型肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒素，可以用來制備生物毒素防治蟲、鼠害，同時抗毒素的研制，可以緊急治療人類因誤食含有肉毒素的食物而中毒，為食品的安全提供一定的保障。
