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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 豬pGH基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 豬生長(zhǎng)激素生物學(xué)效應(yīng)表現(xiàn)為可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和脂肪動(dòng)用，顯著提高豬的生長(zhǎng)速度、飼料報(bào)酬和降低動(dòng)物體脂肪含量，因此構(gòu)建高效表達(dá)pGH基因的載體，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以提高豬的生長(zhǎng)速度，降低飼養(yǎng)成本。本試驗(yàn)采用采用的pEGFP-N1載體含有高效的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子SV40 和PCMV，可以使目的基因在增殖的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。
- 詳細(xì)介紹：
- 本研究采取RT-PCR法，得到pGH基因的cDNA序列，然后通過(guò)設(shè)計(jì)引物得到cDS序列，然后運(yùn)用DNA重組技術(shù)將其連接到T載體上，測(cè)序完成后酶切，連接到表達(dá)載體pEGFP-N1上，得到了可以高效表達(dá)pGH基因的載體，并在PK15細(xì)胞中表達(dá)，本研究在設(shè)計(jì)引物時(shí)，去掉了pGH基因的終止密碼子，使得標(biāo)記基因-熒光蛋白基因和目的基因-pGH基因融合表達(dá)，證明了該載體真核表達(dá)的可實(shí)現(xiàn)性，同時(shí)也快捷的驗(yàn)證了pGH基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，為下一步的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- pGH基因可以顯著提高豬的生長(zhǎng)速度、飼料報(bào)酬和瘦肉率具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 本實(shí)驗(yàn)選擇長(zhǎng)白豬的pGH基因，并對(duì)其進(jìn)行克隆、測(cè)序、連接，得到真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，得到表達(dá)熒光的細(xì)胞圖片，證明了該真核表達(dá)載體的可應(yīng)用性，旨在為進(jìn)一步研究節(jié)糧型高瘦肉率轉(zhuǎn)基因豬，及其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 隨著對(duì)基因表達(dá)調(diào)控、蛋白在活細(xì)胞中自然狀態(tài)下變化的深入研究，人們對(duì)報(bào)告基因或標(biāo)記基因的要求越來(lái)越高。本試驗(yàn)采用采用的pEGFP-N1載體含有高效的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子SV40 和PCMV，可以使目的基因在增殖的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。該載體具有易轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的特點(diǎn)，且EGFP是一種突變體，能在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光，僅需要一定波長(zhǎng)的光激發(fā)，而且不影響靶蛋白的功能和宿主細(xì)胞。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 生長(zhǎng)激素在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著重要的生理功能。豬生長(zhǎng)激素是單一肽鏈蛋白質(zhì)類激素，屬于內(nèi)源激素，但外源GH能顯著改善豬生長(zhǎng)速度、胴體品質(zhì)和生長(zhǎng)效率，同時(shí)減少飼料消耗和豬脂肪沉積。pGH基因可以顯著提高豬的生長(zhǎng)速度、飼料報(bào)酬和瘦肉率具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 從120日齡的長(zhǎng)白豬腦垂體組織中擴(kuò)增出pGH基因的cDNA， 采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 技術(shù)，通過(guò)DNA重組技術(shù)將該基因片段重組于pEGFP-N1真核表達(dá)載體上，構(gòu)建pEGFP-N1-pGH重組質(zhì)粒。通過(guò)PCR擴(kuò)增、酶切電泳分析和測(cè)序的方法對(duì)重組DNA進(jìn)行鑒定，并將其轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)特異性表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pEGFP-N1-pGH真核表達(dá)載體，為轉(zhuǎn)基因豬的研究奠定了基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 無(wú)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1] Lebail P Y, Sire M F ,Vemier J M. 1989.Intestinal transfer for growth hormone into the circulatory system of the rainbow trout salmo gaindneri : interference by granule cell [J] . Exp Z ool , 251 (1) :101. [2] Georgopoulou C ,Sire M F ,Vernier J M.1986. Immunological demonstration of intestinal absorption and digestion of protein macromolecules in the trout ( Salno fai- rdneri) [J] . Cell Tissue Rcs ,245 (2) :387. [3] Mclean E ,Donaldson E M ,Dye H M ,et al.1990.Growth acceleration of coho salmon (Onconhynchus hisutch) following oral administration of recombinant bovine sornstotropin [J] . Aquaculture, 91 :197. [4] Franchimont P,Burger H. 1975.Human Growth Hormone and Gonadotripins in Health and Disease. Amsterdam, Elsevier. [5].Alvarez-Dolado,M.,Pardal,R.,Garcia-Verdugo,J.M.,et al.2003.Fusion of bone marrow-derived cells with Purkinje neurons,cardiomyocytes and hepatocytes.Nature 425,968–973.
同類課題研究水平概述
- 豬生長(zhǎng)激素基因pGH cDNA ORF編碼216個(gè)氨基酸殘基。豬生長(zhǎng)激素基因的原核表達(dá)及其抗體制備：將pGH基因亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T-1中，構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1／pGH。誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果表明出現(xiàn)與預(yù)期一致的1條50.4KDa的特異蛋白新帶，重組pGH得到了正確表達(dá)。分離包涵體形式表達(dá)的融合蛋白GST-pGH，透析得到的重組融合蛋白進(jìn)行家兔免疫，制備并純化抗pGH的多克隆抗體；經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)制備的抗血清對(duì)豬生長(zhǎng)激素具免疫特異性。Western Blotting檢測(cè)結(jié)果表明：豬天然pGH蛋白和融合表達(dá)蛋白GST-pGH能特異性結(jié)合該pGH多抗，豬腦垂體組織的免疫組化分析結(jié)果也證實(shí)了pGH多克隆抗體的特異性。 通過(guò)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC-3.5K／pGH，我們研究了豬生長(zhǎng)激素基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá)。將豬生長(zhǎng)激素(pGH)基因cDNA編碼區(qū)片斷定向插入pMD18-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用菌落PCR和質(zhì)粒PCR方法篩選陽(yáng)性克??；以BamH I和EcoRI酶切鑒定重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用BamH I和EcoR I酶切，膠回收目的酶切片斷并定向插入pPIC-3.5K質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為PPIC-3.5K／pGH。該重組質(zhì)粒經(jīng)SalI酶切線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化GS115酵母，采用MD和MM培養(yǎng)基篩選重組子，提取初篩重組子的基因組DNA。PCR方法進(jìn)一步鑒定，獲得的重組酵母菌以甲醇誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，復(fù)篩得到高效表達(dá)pGH的重組酵母，命名為pPIC-3.5K／pGH／GS115。豬生長(zhǎng)激素基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)：將pGH cDNA亞克隆到真核表達(dá)載體VR1020上，構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒VpGH；利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞株COS_7，分別于24h、48h、72h提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，對(duì)轉(zhuǎn)染后的COS_7細(xì)胞進(jìn)RT-PCR、ELISA和免疫熒光分析。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)總RNA中已含有目的cDNA片段轉(zhuǎn)錄的對(duì)應(yīng)mRNA；ELISA和免疫熒光分析結(jié)果表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的COS_7細(xì)胞中表達(dá)了pGH基因的蛋白產(chǎn)物。
