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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 用β-半乳糖苷酶制備蔗糖生物傳感器核微孔酶膜的方法
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 蔗糖應(yīng)用廣泛，快速準(zhǔn)確地測定其含量對微生物代謝研究、植物學(xué)研究、食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)十分重要。 本研究根據(jù)戊二醛對半乳糖苷酶特異性和穩(wěn)定性影響，發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶在戊二醛作用下活性中心的構(gòu)型會發(fā)生改變，從而酶催化底物由乳糖變?yōu)檎崽?，利用這一特性構(gòu)建出了性能良好的蔗糖酶膜。經(jīng)測定，其穩(wěn)定性、響應(yīng)時間和靈敏度都達(dá)到國際最優(yōu)水平。
- 詳細(xì)介紹：
- 蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖通過α-1，2糖苷鍵連接而成的，是可發(fā)酵糖，廣泛用于發(fā)酵工業(yè)、食品工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室的微生物培養(yǎng)，快速準(zhǔn)確地測定培養(yǎng)液中蔗糖的含量對微生物代謝研究和發(fā)酵過程的調(diào)控十分重要。在食品工業(yè)中需要測定食品成分；監(jiān)測及控制食品加工生產(chǎn)過程中檢驗(yàn)食品質(zhì)量。另外，蔗糖還是植物學(xué)上判斷植株光合作用凈剩余量的指標(biāo)，對蔗糖的準(zhǔn)確監(jiān)測，可以有效地預(yù)測植物的產(chǎn)量，從而為豐產(chǎn)提供依據(jù)。 本研究根據(jù)戊二醛對半乳糖苷酶特異性和穩(wěn)定性影響，發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶在一定濃度的戊二醛作用下活性中心的構(gòu)型會發(fā)生一定的改變從而由專一分解乳糖的酶分子變?yōu)槟軌驅(qū)Ｒ环纸庹崽堑拿阜肿?，并利用這一特性構(gòu)建出性能良好的蔗糖酶膜，由戊二醛為交聯(lián)劑，以β-環(huán)糊精微球作為固定化材料，核微孔膜為固定載體，改性過的β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、牛血清白蛋白為固定對象。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)表明，以下條件：濃度配比為5mg 葡萄糖氧化酶、1ml β-半乳糖苷酶和10mg 牛血清白蛋白溶于1ml蒸餾水中，再以濃度為5%的戊二醛交聯(lián)一小時，在電極中后熟兩天，制得性能最為良好的蔗糖酶膜。 經(jīng)測定，其穩(wěn)定性、響應(yīng)時間和靈敏度都達(dá)到國際最優(yōu)水平。
作品圖片
作品專業(yè)信息
設(shè)計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點(diǎn)、技術(shù)關(guān)鍵和主要技術(shù)指標(biāo)
- 作品設(shè)計、發(fā)明的目的：常用檢測蔗糖方法測定誤差較大，易受溶液顏色和濁度的干擾。國標(biāo)頒布的食品中蔗糖測定方法，雖測定準(zhǔn)確精度高，但操作繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力。本課題的目標(biāo)就是研制出適用于實(shí)驗(yàn)室及發(fā)酵工業(yè)，食品工業(yè)快速便捷的準(zhǔn)確檢測蔗糖的生物傳感器。 基本思路：乳糖酶在一定濃度的戊二醛作用下活性中心的構(gòu)型會發(fā)生一定的改變，從而由專一分解乳糖的酶分子變?yōu)槟軌驅(qū)Ｒ环纸庹崽堑拿阜肿?，并利用這一特性構(gòu)建出蔗糖酶膜，由戊二醛為交聯(lián)劑，以β-環(huán)糊精微球作為固定化材料，核微孔膜為固定載體，牛血清白蛋白為活化劑，改性過的半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶為固定對象。 創(chuàng)新點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種只需要固定化2種酶即可獲得蔗糖生物傳感器核微孔酶膜的方法，利用β-環(huán)糊精作為固定化材料，使用改性過的半乳糖苷酶替代蔗糖轉(zhuǎn)化酶和變旋酶，大大簡化酶膜制作工藝，提高酶固定化效果。 關(guān)鍵技術(shù)：酶的固定——采用交聯(lián)法，所用交聯(lián)劑為戊二醛，固定材料為β-環(huán)糊精微球，固定載體為核微孔膜。 主要技術(shù)指標(biāo)：傳感器的靈敏度、響應(yīng)時間、穩(wěn)定性、使用壽命、線性關(guān)系及線性范圍等都是衡量其性能的重要指標(biāo)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)可知，濃度配制為5mg 葡萄糖氧化酶、1mlβ-半乳糖苷酶和10mg 牛血清白蛋白溶于1ml蒸餾水中，再以濃度為5%的戊二醛交聯(lián)一小時，在電極中后熟兩天，制得蔗糖酶膜。反應(yīng)時間為25s時，線性范圍在0.1%-3%，其中在0.2%-1%蔗糖濃度表現(xiàn)良好的線性，其R2達(dá)到0.9969，其變異系數(shù)在1%以下，使用壽命超過30天。
科學(xué)性、先進(jìn)性
- 科學(xué)性：研究發(fā)現(xiàn)戊二醛能使β-半乳糖苷酶特異性發(fā)生改變，隨著戊二醛濃度和作用時間的增加，β-半乳糖苷酶特異性底物便由乳糖變成了蔗糖，利用這一特性，構(gòu)建出了性能良好的蔗糖酶膜. 蔗糖生物傳感器主要是基于葡萄糖傳感器構(gòu)建電流型酶傳感器，β-半乳糖苷酶將蔗糖分解成果糖和葡萄糖，葡萄糖再被葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸，同時釋放出過氧化氫，過氧化氫與Pt電極接觸后便產(chǎn)生電流。電流的大小和樣品中蔗糖濃度緊密相關(guān)，在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān),從而可以測出蔗糖含量。 先進(jìn)性：現(xiàn)有蔗糖酶膜的制作都是利用蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖變旋酶和葡萄糖氧化酶三酶系構(gòu)建而成的。本發(fā)明方法利用半乳糖苷酶特異性轉(zhuǎn)移的特性制作了葡萄糖氧化酶-半乳糖苷酶雙酶系統(tǒng)蔗糖酶膜，能直接通過兩步便得到目標(biāo)信號物質(zhì)，無論從靈敏度、線性關(guān)系還是使用壽命上都具有令人滿意的性能。
獲獎情況及鑒定結(jié)果
- （1）本發(fā)明提出了專利申請，國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局予以受理。 申報號200910067626.3 申報日期2009年1月6日 （2）利用本發(fā)明方法制作的蔗糖傳感器應(yīng)用于本團(tuán)隊(duì)申請的學(xué)校SRT（大學(xué)生研究訓(xùn)練）項(xiàng)目《利用蔗糖傳感器進(jìn)行蔗糖通量控制的研究》，作為校級“SRT”計劃重點(diǎn)項(xiàng)目并全額發(fā)放項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)。2011年5月遞交結(jié)項(xiàng)報告。 立項(xiàng)時間2010年7月 項(xiàng)目編號2010072
作品所處階段
- 實(shí)驗(yàn)室階段
技術(shù)轉(zhuǎn)讓方式
- 洽談或者合作
作品可展示的形式
- 圖片
使用說明,技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢,適應(yīng)范圍,推廣前景的技術(shù)性說明,市場分析,經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測
- 使用說明：稱取β－環(huán)糊精溶于由NaOH與戊二醛組成的混合溶液中，加熱至晶體分散，發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成帶有活性醛基的多聚β－環(huán)糊精；用蒸餾水洗滌環(huán)糊精，晾干后碾磨成均勻顆粒；將顆粒與混合酶液充分混合，25℃下反應(yīng)80分鐘使酶固定化，均勻涂滿兩張核微孔膜表面。 特點(diǎn)優(yōu)勢、適用范圍：現(xiàn)有蔗糖酶膜是三酶系統(tǒng)，本發(fā)明制作的酶膜只需固定化兩種酶，通過兩步便可得結(jié)果。適用于需要測定蔗糖含量的領(lǐng)域。如食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、微生物代謝研究以及植物學(xué)研究。 經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測：生物傳感器法是迄今最為快速準(zhǔn)確的測糖方法。其優(yōu)點(diǎn)在于 (1)穩(wěn)定性好，分析精度高。分析儀采用性質(zhì)穩(wěn)定的過氧化氫電極或氧電極，工作性能可靠，配套的固定化酶膜能長期使用，穩(wěn)定性好。(2)分析成本低。因采用固定化酶膜作為分析工具，昂貴的酶法分析試劑可反復(fù)使用數(shù)千次，分析成本遠(yuǎn)低于大型分析儀器。(3)分析速度快，樣品用量少。本研究制作的酶膜是雙酶系統(tǒng)，通過兩步便得到目標(biāo)信號物質(zhì)，其靈敏度、線性關(guān)系、使用壽命都達(dá)到國際水平，利于推廣。
同類課題研究水平概述
- 現(xiàn)階段蔗糖傳感器的研究還不是很多，一種是由固定化蔗糖轉(zhuǎn)化酶(INV)，葡萄糖變旋酶(MUT)及葡萄糖氧化酶(GOD)的復(fù)合酶膜組成的過氧化氫雙電極系統(tǒng)，可同時測定樣品中蔗糖和葡萄糖的含量，蔗糖電極的葡萄糖干擾用差分法消除，蔗糖在0-400mg/dl，范圍內(nèi)有線性關(guān)系，連續(xù)測定20 次蔗糖和葡萄糖的變異系統(tǒng)分別為1.13%和1.05%。蔗糖測定回收率為99.62%-100.97%，半衰期為半個月。但由于酶種類的繁多，使制造工藝相對復(fù)雜，且使用壽命較短，故不利于生產(chǎn)推廣。 另一種蔗糖含量在線檢測裝置是由導(dǎo)電針筒與針芯的針形傳感器與電路模塊連接，電路模塊有嵌入式微處理器，其內(nèi)存儲有甘蔗或蔗糖溶液糖含量與脈沖信號作用下產(chǎn)生的電信號關(guān)系數(shù)據(jù)和處理程序。將傳感器針刺入甘蔗皮內(nèi)或浸及溶液，微處理器以50~10kH的電脈沖激勵信號檢測蔗糖溶液或甘蔗的糖含量。被測物的糖含量不同，電阻率不同，其電壓降不同，據(jù)此微處理器換算得到糖含量值?？蓽y糖含量為0%~20%，適于田間作業(yè)的在線檢測。 生物傳感器的研制過程也有諸多難點(diǎn)。其一是如何高效地篩分出高活性的酶。為了使傳感器具有令人滿意的靈敏度，關(guān)鍵是保證有足夠量高活性酶盡可能牢固地固定在半導(dǎo)體片上。同時，為了縮短傳感器的響應(yīng)時間及延長壽命，在工藝上將基膜做的盡可能的薄則成為一個難點(diǎn)。生物傳感器研制的第三個難點(diǎn)是如何改進(jìn)傳感器對應(yīng)用條件的適應(yīng)性與穩(wěn)定性。為了從根本上解決這些難題，自20世紀(jì)90年代以來廣泛采用了可溶解正離子復(fù)合膜、人工生物材料與分子生物材料等新技術(shù)。近年來被學(xué)術(shù)界公認(rèn)為最成功的、最具有實(shí)用性價值的與食品有關(guān)的生物傳感器的應(yīng)用范例有：(1) 形形色色的測量大氣中乙醇、硫、胺、二氧化碳、二氧化氮和其他化學(xué)成分含量的電子鼻，它在食品與飲料制造業(yè)中已大量用于監(jiān)測有害微生物的污染程度以及各種食品的保鮮程度；(2) 快速分析葡萄糖、谷氨酸、乳酸鹽、乳糖、半乳糖等成分的多功能生物傳感器； (3) 通過生物傳感器測量生物肌體內(nèi)三磷酸腺苷(ATP) 的變化而實(shí)現(xiàn)了魚肉新鮮度快速測量。
