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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 綿羊肺炎支原體(M.O)外膜蛋白P40基因的克隆和表達(dá)
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 綿羊傳染性胸膜肺炎是由綿羊肺炎支原體引起的一種慢性呼吸道疾病。 綿羊肺炎支原體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、培養(yǎng)困難，目前仍缺乏有效的診斷和防治措施，給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 本實(shí)驗(yàn)在綿羊肺炎支原體培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，通過自制兔抗綿羊肺炎支原體抗體的簡接ELISA檢測和Western blot初步確定主要的外膜抗原蛋白；根據(jù)功能蛋白基因同源性設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外膜蛋白基因，并嘗試表達(dá)蛋白
- 詳細(xì)介紹：
- 綿羊肺炎支原體( Mycoplasma.ovi pneumoniae ) 是由Mackay 等于1963 年在英格蘭首次從綿羊體內(nèi)分離到的，它能夠引起綿羊和山羊的傳染性胸膜肺炎，是以咳嗽、氣喘、發(fā)燒、漸進(jìn)性消瘦及肺的間質(zhì)增生性炎癥為特征的慢性呼吸道疾病。 由于綿羊肺炎支原體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、培養(yǎng)困難，目前仍缺乏有效的診斷和防治措施，給養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。 研究表明，肺炎支原體蛋白抗原分子為170kD的P1 蛋白質(zhì)具有抗原性及免疫原性，對粘附及致病原理研究有深遠(yuǎn)影響[3]。相關(guān)文獻(xiàn)表明支原體細(xì)胞表面蛋白具有特異性與保守性，D. Thirkell 等人 利用SDS—PAGE及western blot 研究發(fā)現(xiàn)綿羊肺炎支原體主要膜抗原蛋白分子量為26KD，40KD；進(jìn)一步應(yīng)用35S和126I標(biāo)記技術(shù)研究證明26KD 和40 KD 位于細(xì)胞的外膜。 本課題在培養(yǎng)和鑒定綿羊肺炎支原體的基礎(chǔ)上，首先通過SDS-PAGE分析初步鑒定綿羊肺炎支原體外膜蛋白的分子量范圍；然后進(jìn)行自制兔抗綿羊肺炎支原體抗體的簡接ELISA檢測和Western blot初步確定主要的外膜抗原蛋白；根據(jù)功能蛋白基因同源性設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外膜蛋白P40基因序列，連接克隆載體進(jìn)行測序，在NCBI比對該基因與豬肺炎支原體基因的同源性達(dá)到90%?？寺⌒蛄腥L1101 bp ,編碼367個氨基酸和一個終止子(TAA) ;該序列中含有3 個TGA 編碼Trp ，而不是終止密碼子。如果繼續(xù)在原核表達(dá)，需要將TGA突變成TGG，然后構(gòu)建表達(dá)載體，嘗試蛋白表達(dá)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的: 利用免疫學(xué)和克隆基因原核表達(dá)的方法，確定表達(dá)蛋白的免疫原性,為闡明M.O的致病機(jī)理和免疫機(jī)制及研究工程疫苗、促進(jìn)本病診斷技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。 基本思路: 1、培養(yǎng)M.O。 2、提取綿羊肺炎支原體全蛋白，制備抗原免疫新西蘭兔。 3、簡接ELISA測抗體效價，Western blot初步確定主要的外膜抗原蛋白。 4、克隆主要外膜抗原蛋白的基因。 5、表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白表達(dá)
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 綿羊肺炎支原體序列的全基因測序，目前國內(nèi)外研究是通過對綿羊肺炎支原體菌體蛋白進(jìn)行粗提后，初步鑒定其分子量和免疫原性。 本實(shí)驗(yàn)在綿羊肺炎支原體培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，通過自制兔抗綿羊肺炎支原體抗體的簡接ELISA檢測和Western blot初步確定主要的外膜抗原蛋白；根據(jù)功能蛋白基因同源性設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外膜蛋白基因，并嘗試表達(dá)蛋白
應(yīng)用價值和現(xiàn)實(shí)意義
- 為闡明綿羊肺炎支原體的致病機(jī)理和免疫機(jī)制以及研究其基因工程疫苗和促進(jìn)本病診斷技術(shù)的發(fā)展奠定基礎(chǔ)
學(xué)術(shù)論文摘要
- 綿羊傳染性胸膜肺炎是由綿羊肺炎支原體引起的一種慢性呼吸道疾病，由于綿羊肺炎支原體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、培養(yǎng)困難，目前仍缺乏有效的診斷和防治措施，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本課題在培養(yǎng)和鑒定綿羊肺炎支原體的基礎(chǔ)上，首先通過SDS-PAGE分析初步鑒定綿羊肺炎支原體外膜蛋白的分子量范圍；然后進(jìn)行自制兔抗綿羊肺炎支原體抗體的簡接ELISA檢測和Western blot初步確定主要的外膜抗原蛋白；根據(jù)功能蛋白基因同源性設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外膜蛋白P40基因序列，連接克隆載體進(jìn)行測序，在NCBI比對該基因與豬肺炎支原體基因的同源性達(dá)到90%?？寺⌒蛄腥L1101 bp ,編碼367個氨基酸和一個終止子(TAA) ;該序列中含有3 個TGA 編碼Trp ，而不是終止密碼子。如果繼續(xù)在原核表達(dá)，需要將TGA突變成TGG，然后構(gòu)建表達(dá)載體，嘗試蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)時未做PCR定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建了表達(dá)載體PET-28a-40和 PET-32a-40，經(jīng)ELISA和Western blot確定P40和P30為主要外膜抗原蛋白。
獲獎情況
- 2011年河北師范大學(xué)課外學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新競賽二等獎
鑒定結(jié)果
- 培養(yǎng)M.O，通過ELISA和Western blot初步確定M.O的主要外膜抗原蛋白是P40、P30；據(jù)同源基因的相似性克隆P40；構(gòu)建PET-28a-40和 PET-32a-40；表達(dá)蛋白失敗。
參考文獻(xiàn)
- 應(yīng)用技術(shù)： 1．簡接ELISA實(shí)驗(yàn)； 2．Western blot（免疫印跡）實(shí)驗(yàn)； 3.分子克隆技術(shù)：PCR,膠回收，質(zhì)粒小提，連T轉(zhuǎn)化，雙酶切； 4．表達(dá)載體構(gòu)建； 5．SDS-PAGA電泳制備 。 文獻(xiàn)檢索目錄： 1．中國知識資源總庫——CNKI 系列數(shù)據(jù)庫； 2．SpringerLink 3．National Center for Biotechnology Information
同類課題研究水平概述
- 目前，針對綿羊肺炎支原體國外除在診斷、免疫、流行病學(xué)及防治方面已進(jìn)行深入研究外，更多應(yīng)用了新技術(shù)、新方法結(jié)合細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)及分子生物學(xué)進(jìn)行研究，從而帶動了發(fā)病機(jī)理的研究，取得了支原體研究的很大發(fā)展，國內(nèi)在一些方面雖然取得了一些可喜的進(jìn)展，但距離國外的研究水平還有很大的差距。到目前為止關(guān)于綿羊肺炎支原體的研究還較少，均局限于菌種的分離鑒定，檢測技術(shù)以較簡單的抗原蛋白分析。國內(nèi)王建昌等采取改良的膜蛋白提取方法，采用SDS?-PAGE和Western blot分析了綿羊肺炎支原體Y98外膜保護(hù)性抗原蛋白成分，利用間接ELSA和MTT法對外膜抗原蛋白引起的細(xì)胞免疫和細(xì)胞免疫功能進(jìn)行了鑒定，表明外膜蛋白為綿羊肺炎支原體重要的保護(hù)性抗原。
