基本信息
- 項目名稱：
- PCR-SSP法檢測29種HLA-B27亞型
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本次檢測強制性脊柱炎(ＡＳ)方法是在新的高分辨ＰＣＲ－ＳＳＰ法基礎上建立起來的。與以往檢測相比，此法充分考慮所設計引物的特異性，實驗結果表明，此法能夠檢測出以往方法不能達到的２９條基因亞型。該法根據內對照及有無特異性區(qū)帶使判定結果一目了然，可以快速準確的對ＨＬＡ－Ｂ２７的相關亞型進行檢測，從亞型水平探究AS的發(fā)病機制，提供了臨床上早期診斷AS的新方法。
- 詳細介紹：
- 本次檢測強制性脊柱炎(ＡＳ)方法是在新的高分辨ＰＣＲ－ＳＳＰ法基礎上建立起來的。與以往只能檢測７～２３條亞型的不足而造成的缺乏性和完整性不足相比，此法充分考慮所設計引物的特異性，并對多數已有的ＰＣＲ檢測條件做出相應調整，實驗結果表明，此法能夠檢測出以往方法不能達到的２９條基因亞型。該法根據內對照及有無特異性區(qū)帶使判定結果一目了然，可以快速準確的對ＨＬＡ－Ｂ２７的相關亞型進行檢測，從亞型水平探究AS的發(fā)病機制，提供了臨床上早期診斷AS的新方法，為進一步研究ＨＬＡ－Ｂ２７與疾病的關聯(lián)，深入探討ＡＳ的發(fā)病機制奠定了基礎。同時與傳統(tǒng)醫(yī)學檢測手段相比，本檢測手段可以較全面檢測盡可能多分子亞型，對器材要求低，速度快，在基因水平診斷上,具有良好的預見性,非常適于臨床應用。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的:建立一種新的聚合酶鏈反應-序列特異性引物（PCR-SSP）高分辨技術檢測HLA-B27基因亞型，為HLA-B27基因多態(tài)性研究奠定實驗學基礎。 基本思路: 設計合成HLA-B27亞型特異性引物35條（配對組成上下游引物組合29對）和內對照引物一對，建立PCR-SSP方法，用于B27亞型分型。檢測標本HLA-B27陽性研究對象外周血基因組DNA。
科學性、先進性及獨特之處
- 科學性：由于HLA-B27基因在不同人群分布有明顯的差異且不同的抗原也存在差別，從分子水平研究HLA-B27亞型與AS的相關性更準確。 先進性：該法具有高度特異性、敏感性、實驗操作簡便快速、對樣本要求低和無需昂貴設備等特點，內對照的引入更保證了檢測結果的可靠性。 獨特性：高分辨HLA-B27亞型檢測可分析多達29種亞型；根據內對照及有無特異性區(qū)帶使判定結果一目了然、快速準確。
應用價值和現(xiàn)實意義
- PCR-SSP法從基因的多態(tài)性出發(fā)，可以檢測HLA-B27的32種亞基中的29種，范圍更廣，滿足當前醫(yī)學檢測需要。與血清法、流式細胞術等相比具有準確性高、靈敏度強、耗材少、用時少、成本低等優(yōu)越性，更適用于醫(yī)學類尤其是醫(yī)院檢測。且在臨床上對于AS的早期診斷和治療具有重要意義，適于患者早期確診，區(qū)分類風濕類疾病與AS患者，避免誤診。本實驗進一步證明AS與HLA-B27的相關性，具有醫(yī)學意義。
學術論文摘要
- 目的 建立一種新的聚合酶鏈反應-序列特異性引物（PCR-SSP）高分辨技術檢測29種HLA-B27基因亞型。方法 設計合成HLA-B27亞型特異性引物35條（配對組成上下游引物組合29對）和內對照引物一對，建立PCR-SSP方法，用于B27亞型分型。檢測標本為117例HLA-B27陽性研究對象（男79名，女38名）外周血基因組DNA 。 結果 117例標本的PCR-SSP擴增均獲得成功，成功的構建了PCR-SSP檢測反應體系。共檢測出6種亞型：B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706及B*2713。六種亞型的構成比分別為：0.85%、6.84%、64.10%、25.64%、1.71%、0.85%，其中B*2704和B*2705為中國漢族人群中主要亞型。 結論 應用該新型PCR-SSP高分辨技術進行HLA-B27基因亞型檢測能檢測出較多HLA-B27亞型，且該法進行B27亞型分型分辨度高、特異性強，成本較低，適合于臨床應用。
獲獎情況
- 于《分子診斷與治療雜志》（ISSN 1674-6929；CN 44-1656/R）2011年5月第3期刊發(fā)
鑒定結果
- 117例標本擴增均獲得成功，構建了PCR-SSP檢測反應體系。 共檢測出6種亞型：B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706及B*2713。
參考文獻
- [1]Schlosstein L, Terasaki PI, Bluestones R, et al. High association of an HL-A antigen, B27, with ankylosing spondylitis. N Engi J Med, 1973, 288:704-706. [2]Brewerton DA, Caffrey M, Hart FD, et al. Ankylosing spondylitis and HLA-B27. Lancet, 1973, 1 (7809): 904-907. [3]Taurog JD. The Mystery of HLA–B27: If It Isn’t One Thing, It’s Another. Arthritis Rheum, 2007, 56: 2478-2481. [4] Dowing J, Coates E, Street J, et al. A High-Resolution Polymerase Chain Reaction-Sequence-Specific Primer HLA-B*27 Typing Set and Its Application in Routine HLA-B27 Testing. Genet Test, 2006, 10:98–103. [5]Downing J, Guttridge MG, Thompson J, et al. Five-locus HLA typing of haematopoietic stem cell donor volunteers by PCR using sequence specific primers. Genet Test , 2004, 8:301–312. [6] 李一榮，胡麗華，陳鳳花，等. 應用SYBR GreenⅠ實時熒光PCR法對中國漢族人群HLA-B27進行快速基因分型. 臨床血液學雜志，2008，21（5）：526-529. [7] 馮忠軍，賀端明. HLA-B27的檢測及其臨床應用. 河北醫(yī)，2008.1，30（1）：90-92. [8] 張相文，蘭炯采，鄭世榮. HLA-B27PCR基因分型及血清學結果比較. 中國輸血雜志，1997,10：671.
同類課題研究水平概述
- 目前檢測HLA-B27基因亞型手段中，常用的有經典的血清學分型技術、流式細胞術及磁珠酶聯(lián)免疫檢驗法和基因分型技術，不常用的有玫瑰花法、ELISA法等。 1,微量淋巴細胞毒法 HLA- B27抗原與其特異性抗體結合.優(yōu)點: 操作簡便，準確率尚可且,成本較低;缺點:單價血清獲取困難，受細胞純度、補體差異、操作繁瑣，單抗效價及HLA高度多態(tài)性的影響，易出現(xiàn)錯判漏判. 2, 流式細胞技術 流式細胞技術結合單克隆抗體，可以迅速區(qū)分出淋巴細胞亞群，并檢測出CD+3細胞中HLA-B27抗原陽性的細胞百分比.優(yōu)點: 可以迅速區(qū)分出淋巴細胞亞群,結果精確;缺點:HLA-B27單克隆抗體和儀器只有較大醫(yī)院才擁有。 3, 磁珠酶聯(lián)免疫檢驗法 結合磁珠分離和酶聯(lián)免疫分析,分離全血中HLA-B27抗原及白細胞及染色。優(yōu)點:特異性強,敏感度高,重復性好。缺點:操作步驟復雜。 4, HLA基因分型技術 目前檢測HLA-B27亞型的基因分型技術主要有聚合酶鏈反應-序列特異性引物（PCR-SSP），DNA 限制性片段長度多態(tài)性分析, PCR-單鏈構象多態(tài)性及PCR-DNA測序等方法。最為常用的為PCR-SSP，其優(yōu)點為: 準確性高、靈敏度強、耗材少、用時少、成本低等優(yōu)越性，更加適用于醫(yī)學類尤其是醫(yī)院檢測. 缺點:易受感染出現(xiàn)假陰性和標本的DNA交叉污染. 文獻資料顯示，絕大多數實驗室采用檢測HLA-B27方法為微量淋巴細胞毒試驗檢測法. HLA基因分型技術較血清學分型有以下優(yōu)點：(1)只需全血0.5 ml即可獲得足夠數量的DNA，并可重復數十次試驗；(2)可保存于無水乙醇中，視其純度存放多年；(3)由于加入了429 bpHGH內對照引物，使實驗方法更加可靠，避免出現(xiàn)漏檢和假陽性反應；(4)實驗快捷簡便，特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好。微量的DNA就可以擴增達到106～107倍的量，達到常規(guī)方法檢測所需的濃度. 由于受HLA基因分型技術的限制，以往的研究中往往只能分析少量HLA-B27亞型，從亞型水平探討AS的發(fā)病機制的研究結果缺乏精確性與完整性。因此創(chuàng)建的一種新的PCR-SSP高分辨技術，以檢測到更多種HLA-B27基因亞型，為進一步研究HLA-B27基因亞型與AS的關系打下實驗室基礎，這是國內外許多學者研究的熱點之一。
