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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 堿性蛋白酶的低溫改造
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本試驗(yàn)采用error-prone PCR和DNA shuffling方法對(duì)嗜堿芽孢桿菌堿性蛋白酶基因apr4M進(jìn)行突變，利用E.coli-Bacillus穿梭表達(dá)載體pBE2R，在大腸桿菌中建立突變文庫，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600，構(gòu)建枯草芽孢桿菌突變基因庫，結(jié)合脫脂乳平板初篩、96孔板復(fù)篩獲得了一株在低溫下酶活性有所提高的突變子3A30。
- 詳細(xì)介紹：
- 堿性蛋白酶（TC263）屬于絲氨酸蛋白酶，由269個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子中沒有二硫鍵。本試驗(yàn)采用error-prone PCR和DNA shuffling方法對(duì)嗜堿芽孢桿菌堿性蛋白酶基因apr4M進(jìn)行突變，利用E.coli-Bacillus穿梭表達(dá)載體pBE2R，在大腸桿菌中建立突變文庫，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600，構(gòu)建枯草芽孢桿菌突變基因文庫，結(jié)合脫脂乳平板初篩、96孔板復(fù)篩獲得了一株在低溫下酶活性有所提高的突變子3A30。該突變子所產(chǎn)堿性蛋白酶最適反映溫度為50℃，但在20℃時(shí)的酶活力較TC263提高了30%，為8400U/mL; 該突變子產(chǎn)酶的熱穩(wěn)定性較差，在50℃保溫1h殘留酶活力為43%，而野生型酶的殘留活力為82%。測(cè)序結(jié)果表明，該突變體中有5個(gè)氨基酸發(fā)生了替換，由于這5個(gè)氨基酸的替換，使得蛋白酶在低溫下的酶活力有了提高。這為新型洗滌劑用低溫堿性蛋白酶的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 為解決工業(yè)生產(chǎn)蛋白酶在低溫下的應(yīng)用問題，本課題以課題組已有的高產(chǎn)中溫堿性蛋白酶的嗜堿芽孢桿菌為研究起點(diǎn)，通過基因工程技術(shù)、酶技術(shù)構(gòu)建出高產(chǎn)的低溫堿性蛋白酶優(yōu)良工程菌株，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，使其實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效表達(dá)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1．首次利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行基因突變庫的構(gòu)建，可直接對(duì)突變基因進(jìn)行活性篩選和鑒定，降低了篩選工作量。 2.通過比較低溫堿性蛋白酶與其他不同特性的堿性蛋白酶的區(qū)別，確定影響堿性蛋白酶耐低溫、高酶活力、以及穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸殘基。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 本作品利用error-prone PCR和DNA shuffling技術(shù)對(duì)嗜堿芽孢桿菌堿性蛋白酶基因進(jìn)行低溫改造，得到突變子3A30，其所產(chǎn)酶在20℃時(shí)的活力較野生型提高了30%，為新型洗滌劑用低溫堿性蛋白酶的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，響應(yīng)了國(guó)家“節(jié)能減排、綠色環(huán)保、以及可持續(xù)發(fā)展”的號(hào)召，創(chuàng)建“酶”好家園。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 堿性蛋白酶是目前市場(chǎng)上流行的洗滌添加劑，能大幅度提高洗滌去污能力，特別是對(duì)汗?jié)n、奶漬、油漬等蛋白類污垢,具有獨(dú)特的洗滌效果。其主要成分為枯草桿菌蛋白酶，屬中溫酶，通常在40-60℃具有最佳的酶活力，不適于目前低碳、環(huán)保、節(jié)能的發(fā)展趨勢(shì)。本試驗(yàn)采用error-prone PCR和DNA shuffling方法對(duì)嗜堿芽孢桿菌堿性蛋白酶基因apr4M進(jìn)行突變，利用E.coli-Bacillus穿梭表達(dá)載體pBE2R，在大腸桿菌中建立突變文庫，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600，構(gòu)建枯草芽孢桿菌突變基因文庫，結(jié)合脫脂乳平板初篩、96孔板復(fù)篩獲得了一株在低溫下酶活性有所提高的突變子3A30。該突變子所產(chǎn)堿性蛋白酶最適反映溫度為50℃，但在20℃時(shí)的酶活力較野生型菌株提高了30%，為8400U/mL; 該突變子產(chǎn)酶的熱穩(wěn)定性較差，在50℃保溫1h殘留酶活力為43%，而野生型酶的殘留活力為82%。這為新型洗滌劑用低溫堿性蛋白酶的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
獲獎(jiǎng)情況
- 無
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- [1] Samad Jahandideh，Parviz Abdolmaleki，Mina Janandideh，Ebrahim Barzegari Asadabadi．Sequence and structural parameters enhancing adaptation of proteins to low temperatures[J]．Journal of Theoretical Biology，2007，246（1）：159-166． [2] Runying Zeng，Rui Zhang，Jing Zhao，Nianwei Lin．Cold-active serine alkaline protease from the psychrophilic bacterium Pseudomonas strain DY-A：enzyme purification and characterization[J]．Extremophiles，2003，7(4)：335-337． [3] Tang X M, Shen W, Lakay F M, Shao W L, Wang Z X, Prior B A,Zhuge J. Cloning and over-expression of an alkaline protease from Bacillus licheniformis.Biotechnol Lett, 2004，26(12): 975-979． [4] Sandy Primrose, Richard Twyman, Bob Old. Principles of Gene Manipulation[M]. Higher Education Press. 150-158. [5] Frances H Arnold，Patrick L Wintrode，Kentaro Miyazaki，Anne Gershenson．How enzymes adapt：lessons from directed evolution[J]．Trends in Biochemical Sciences，2001，26(2)：100-106．
同類課題研究水平概述
- 由于低溫堿性蛋白酶的廣泛應(yīng)用和對(duì)工業(yè)以及人們生活帶來的巨大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，我國(guó)政府早在“七五”和“八五”期間就開始組織專家進(jìn)行堿性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選和發(fā)酵研究，中科院微生物研究所邱秀寶等人曾從適冷性海洋微生物中篩選到210株產(chǎn)蛋白酶的菌株，并發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)低溫堿性蛋白酶活力較高的海洋細(xì)菌，經(jīng)過UV誘變后獲得一突變株N1-35，經(jīng)發(fā)酵后，其發(fā)酵液在20℃下酶活提高到100U/ml左右，但當(dāng)溫度升高到40℃以上10min后，酶活迅速下降?！熬盼濉焙汀笆濉逼陂g，山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳秀蘭等人，從渤海灣海水中篩選得到了一株20℃下產(chǎn)堿性蛋白酶為320U/ml的低溫菌株，但該菌株所產(chǎn)蛋白酶在50℃下保溫20min后，酶活就喪失75%以上（海洋生物863資助項(xiàng)目）。另外，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院的孫謐等人，在完成863項(xiàng)目“海洋堿性蛋白酶和溶菌酶的研究與開發(fā)”的過程中，通過復(fù)合誘變?cè)|(zhì)體的方法獲得了一株低溫堿性蛋白酶高產(chǎn)菌，該菌20℃下發(fā)酵液的酶活達(dá)到了4000U/ml，但是仍然不能滿足產(chǎn)業(yè)化的要求。這些直接分離純化得到的低溫堿性蛋白酶大多來源于嗜低溫菌和耐低溫菌，如假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、異單胞菌屬等，這些菌的最適生長(zhǎng)溫度和產(chǎn)酶溫度一般都較低，約在10～20℃范圍內(nèi)，所產(chǎn)堿性蛋白酶此溫度下也具有相對(duì)較高的酶活；但它們同時(shí)也存在一個(gè)致命的缺陷，即對(duì)溫度極度敏感，熱穩(wěn)定性差[2]，這大大限制了它們的加工特性和應(yīng)用，尤其是在紡織印染、制革和洗滌劑行業(yè)中的應(yīng)用。 國(guó)外的研究除進(jìn)行低溫堿性蛋白酶產(chǎn)生菌的發(fā)現(xiàn)外，還著重于對(duì)中溫堿性蛋白酶的耐低溫特性的改造上，其中最引人注目的是Giulio等人對(duì)大量適冷酶結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)分析得出的結(jié)論，即把中高溫堿性蛋白酶的α螺旋外側(cè)Glu突變成Ala，是中高溫蛋白酶人工定向進(jìn)化低溫堿性蛋白酶首先考慮的關(guān)鍵點(diǎn)。
