基本信息
- 項目名稱：
- 中國蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫的構建及部分ESTs分析
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本實驗在成功構建大連蛇島蝮蛇毒腺全長cDNA文庫的基礎上，對部分序列進行隨機克隆和ESTs測序，通過與NCBInr數(shù)據(jù)庫比對、查詢和注釋，對獲得的195個有效序列進行分析。該全長cDNA文庫的構建成功以及部分ESTs序列的獲得，為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達和功能研究奠定了基礎。今后可以利用所構建的GSSG-cDNA文庫，在大規(guī)模測序的基礎上，進一步開展蛇島蝮蛇功能基因的研究。
- 詳細介紹：
- 一．材料與方法 1.材料與試劑 GSS由遼寧蛇島老鐵山自然保護區(qū)管理處提供；Poly (A) PuristTM 試劑盒、DNA Marker、TaKaRa RNAiso Reagent、載體、各種限制性內(nèi)切酶、宿主細胞為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit為Clontech公司產(chǎn)品。EB、苯酚為Sigma 公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。 2.cDNA文庫的構建采用SMART技術，以pDNR-LIB為載體，E. coli DH10B為宿主菌構建中國蛇島蝮蛇毒腺的cDNA文庫。 3.cDNA克隆的序列測定1.cDNA文庫菌液的擴增 2.cDNA文庫質粒的提取 4.ESTs的獲得與分析 獲得的文庫質粒序列用Chromas 剔除pDNR-LIB載體序列以及包含的接頭序列，得到每個克隆的EST序列信息，再通過Stackpack軟件將獲得的序列進行拼接，獲得UniGenes，通過NCBInr蛋白質數(shù)據(jù)庫進行Blast X檢索和序列比對，分析基因的功能并將其分類，對應的克隆保存、備用。 二．結果與分析 1. cDNA文庫質量檢測 以pDNR-LIB為載體，構建了GSSG-cDNA文庫，其原始文庫庫容量為8×107 cfu/mL，隨機從文庫中挑選單菌落進行菌液PCR鑒定表明，大多數(shù)插入片段均大于1000 bp，表明所構建的cDNA文庫是高質量的。這是我國第一個GSSG-cDNA文庫。 2. cDNA文庫質粒鑒定 cDNA文庫用堿裂解法提取質粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。所得到的電泳圖表明我們已構建了完整的GSSG-cDNA文庫。 三．實驗意義 本實驗中，全長cDNA文庫的構建成功以及部分ESTs序列的獲得，為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達和功能研究奠定了基礎。 今后可以利用所構建的GSSG-cDNA文庫，在大規(guī)模測序的基礎上，通過EST序列分析等手段進一步開展蛇島蝮蛇功能基因研究。蛇毒中含有多種酶類和多肽，這些物質和酶類不僅具有很強的毒理作用，而且還具有治癌、抗凝、止血、鎮(zhèn)痛等作用，具有很高的藥用和醫(yī)用價值，因而引起國內(nèi)外醫(yī)藥界的普遍重視，在臨床應用中發(fā)揮著極其重要的作用，并且具有較高的經(jīng)濟效益,因此具有很高的開發(fā)價值，是一個值得開拓、前景廣闊的領域。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：構建大連蛇島蝮蛇毒腺cDNA文庫，在大規(guī)模測序的基礎上，獲得ESTs標簽，為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達和功能研究打下基礎。 基本思路:(1)構建大連蛇島蝮蛇毒腺的cDNA文庫（GSSG-cDNA)； (2)cDNA克隆測序； (3)ESTs標簽的獲得與分析
科學性、先進性及獨特之處
- 采用SMART技術構建cDNA文庫，保證了cDNA序列信息的完整性。該方法簡便易行，獲得全長基因的幾率大，同時也可以獲得低豐度表達基因。ESTs序列的獲得，為進一步開展蛇島蝮功能基因研究打下基礎。而且，這是我國第一個GSSG-cDNA文庫，具有首創(chuàng)性。能進一步發(fā)現(xiàn)目前人們尚不知道的基因，拓寬對蛇毒的認識，為進一步開發(fā)蛇島蝮蛇的毒液組分的藥物功能奠定了基礎，應用前景廣闊。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 利用所構建的GSSG-cDNA文庫，對GSS蛋白活性組分進行基因克隆、蛋白表達和功能研究，進而研發(fā)有效藥物，應用于臨床。
學術論文摘要
- 摘要：采用SMART(Switching mechanism at 5'end of RNA transcript)技術，構建了中國蛇島蝮蛇（Gloydius shedaoensis shedaoensis, GSS）毒腺(GSSG)的cDNA(GSSG-cDNA)文庫。經(jīng)測定，構建的GSSG-cDNA庫容量為8×10^7 cfu/mL，大多數(shù)插入片段均大于1000 bp，結果表明GSSG-cDNA文庫已構建成功。對隨機挑選的200個克隆進行序列測定，獲得有效序列195個。通過與NCBInr蛋白質數(shù)據(jù)庫進行Blast X比對分析，得到84個克隆為已知功能基因，17個克隆為未知功能基因，94個克隆為新基因，分別占有效序列的43.1%、8.7%和48.2%。該全長cDNA文庫的構建成功以及部分ESTs序列的獲得，為GSS蛋白活性組分基因的克隆、蛋白表達和功能研究奠定了基礎。 關鍵詞：蛇島蝮；cDNA文庫；ESTs
獲獎情況
- 2011年4月獲得大連醫(yī)科大學第五屆大學生課外學術科技作品競賽自然科學類學術論文一等獎
鑒定結果
- 無
參考文獻
- 技術：(1)SMART技術;(2)通過生物信息學Chromas和Stackpack軟件獲得ESTs，并通過NCBInr蛋白質數(shù)據(jù)庫進行檢索和序列比對。 檢索目錄:[1]表達序列標簽（EST）在基因組學研究中的應用。生物技術通報 2004; 1:34-38. [2] 劉淑清，馬馳，宗軍衛(wèi)，等。雙向電泳結合質譜初步分析蛇島蝮蛇毒蛋白質組。動物學雜志2009; 44(4):70-77.
同類課題研究水平概述
- 蛇毒是毒蛇腺體中分泌出來的一種毒液，含有復雜的蛋白質毒素，其成分是蛋白質或多肽類物質，還含有多種重要的酶類，這些物質和酶類不僅具有很強的毒理作用，而且還具有治癌、抗凝、止血、鎮(zhèn)痛等作用，具有很高的藥用和醫(yī)用價值，因而引起國內(nèi)外醫(yī)藥界的普遍重視，并進行了許多研究工作。 國際上，一種新型抗蛇毒血清新藥在法國研制成功；日本科學家發(fā)現(xiàn)了蛇毒阻礙血液凝固的機制，在蛇毒中天然存在的有抗凝固作用的蛋白質，它在開發(fā)和設計新的抗血液凝固劑時有著重要的利用價值；美國科學家還發(fā)現(xiàn)蛇毒中的蛋白質具有抗癌作用。 目前，我國醫(yī)學界和生物學界的研究課題主要有三個研究方面：一是蛇毒的化學成分和毒、藥理作用的研究；二是抗蛇毒血清的研究；三是蛇毒應用的研究。隨著蛇毒研究事業(yè)的蓬勃發(fā)展，我國對蛇毒研究和臨床應用的進展很快，并取得了可喜的成果。例如：昆明動物研究所從浙江蝮蛇毒中提純的磷酸二酯酶，該產(chǎn)品質量達到了國外同類產(chǎn)品的先進水平；中國醫(yī)科大學蛇毒研究室從蛇島的蝮蛇和江浙蝮蛇毒中分離出"蛇毒抗栓酶"；解放軍二三八醫(yī)院與沈陽藥學院合作，從東北陸生的蝮蛇毒中分離出"清栓酶"制劑;貴州大學生命科學學院發(fā)現(xiàn)TMAC-1可通過酶切補體特定成分抑制補體活性；廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院證實從白眉蝮蛇蛇毒中提取出的細胞毒素H1有抑制實驗性大鼠胃癌生長和轉移的作用等。 蛇毒中含有多種酶類和多肽，在臨床應用中發(fā)揮著極其重要的作用，并且具有較高的經(jīng)濟效益。因此具有很高的開發(fā)價值，是一個值得開拓、前景廣闊的領域。
