基本信息
- 項目名稱：
- AQP9在不同砷敏感性哺乳動物細胞中的表達比較
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- AQP是膜主體內在蛋白家族成員，目前在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)11種AQP亞型，即AQP0-AQP10。它們在多種細胞膜上表達，作為通道蛋白參與細胞內外液體的轉運。不同的家族成員其cDNA序列具有高度同源性，氨基端結構極其相似，提示其決定AQP家族功能的共性。已有大量的研究證實AQP9在砷的入胞機制中發(fā)揮重要作用，明確認為AQP9是負責細胞砷攝入的通道蛋白。
- 詳細介紹：
- 1.項目實施情況；2.項目研究內容及方法的創(chuàng)新；3.項目成果的學術價值；4.項目成果的社會效益和經(jīng)濟效益；5.研究存在的不足或欠缺，尚需深入研究的問題等。1500字左右。 1項目實施情況：基本按項目內容實施。 2 研究內容： ① 培養(yǎng)對砷具有不同敏感性的細胞，MTT法檢測其LC50； ② 檢測對砷不同敏感性細胞內AQP9表達水平及磷酸化水平：RT-PCR檢測不同敏感性細胞內AQP9 mRNA表達水平，Western-blot檢測AQP9蛋白表達水平及其磷酸化水平。 ③ 分別用濃度2、4、8、16、32μM的砷加壓培養(yǎng)砷不同敏感性細胞，不加砷處理的細胞作為對照，采用RT-PCR檢測AQP9 mRNA表達水平，Western blot檢測AQP9蛋白表達水平和磷酸化水平，原子熒光法測定細胞內砷含量。 ④ AQP9磷酸化位點突變對細胞內砷攝入的影響：對AQP9蛋白序列進行磷酸化位點分析，通過PCR擴增磷酸化位點突變的AQP9全長cDNA,構建入pcDNA3.1真核表達載體，轉染進入AQP9基礎表達較低的細胞中，Western blot檢測AQP9表達水平和磷酸化水平，原子熒光法測定細胞內砷含量。 本項目所采用的技術方法均為國際上通用的分子生物學技術方法，其技術水平在本領域中應屬前沿。 3 學術價值：為深入研究依賴于AQP9的砷攝入的分子機制奠定基礎，對砷的中毒防治具有重要意義，也能讓我們更好地利用它來治療各種惡性疾病。 4 項目成果的社會效益：本項目作為深入研究依賴于AQP9的砷攝入的分子機制中的一部分，如何實驗結果支持我們所提出的假設，證明AQP9的磷酸化確實調控細胞砷攝入水平，那我們今后可以開發(fā)AQP9磷酸化抑制劑類產(chǎn)品，來提高細胞對砷的敏感性，增強砷作為癌癥治療藥物的效果，解決砷的臨床耐藥問題。本項目將為此類產(chǎn)品的開發(fā)提供理論支持。目前而言，尚無盈利能力，產(chǎn)品的成熟開發(fā)亦需時日。 5 存在的不足和需要深入研究的問題：本項目實施過程中還存在很多不足和缺陷，由于課程較多，用于項目研究的時間相對較少。另外，由于是初次接觸科學研究，對于很多技術方法還不能熟練運用，花費了較多時間用于實驗條件的摸索；另外也花了較多時間用于熟悉該領域的相關研究進展，因此實驗進程較緩慢，有些結果還較為粗糙，需要進一步重復和驗證。需要深入研究的問題是進一步明確AQP9的表達及磷酸化由哪種信號通路與蛋白或酶所調控，并且這種調控作用是否是直接強效的，對砷的攝入又產(chǎn)生了什么樣的影響等等。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 研究采用本實驗室前期已經(jīng)誘導得到ECV304抗砷細胞株、肝癌細胞株HepG2以及肝實質性細胞L-02為實驗對象，采用熒光定量PCR和Western blotting對各種砷不同敏感性細胞中AQP9的RNA和蛋白表達水平進行比較分析，并采用同樣的方法對加砷誘導后這四類細胞中AQP9的RNA和蛋白表達水平進行比較分析。以探討AQP9在抗砷性細胞株中的表達水平與其抗砷性之間的關系，為闡述其機制奠定基礎。
科學性、先進性及獨特之處
- 研究證實AQP9是砷的入胞通道之一，其作用機制尚不明確。實驗選取四種哺乳類細胞株，采用熒光定量PCR和Western blotting對砷不同敏感性細胞中AQP9的RNA和蛋白表達水平進行比較分析，并采用同樣的方法對加砷誘導后這四類細胞中AQP9的RNA和蛋白表達水平進行比較分析。以探討AQP9在抗砷性細胞株中的表達水平與其抗砷性之間的關系，為闡述其機制奠定基礎。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 砷幾千年來作為藥物治療腫瘤等一些難治病有較為明確的療效，但其臨床使用所產(chǎn)生的耐藥性是阻礙其使用的一個難題。本項目檢測抗砷性細胞中AQP9的mRNA表達水平和蛋白表達水平，探討AQP9對細胞抗砷性中的作用機制，為解決砷耐受性難題提供理論基礎和潛在靶點。
學術論文摘要
- 目的：研究三氧化二砷（As2O3）對人ECV-304細胞株、抗砷性ECV-304（AsRE，本實驗室前期低劑量砷誘導得到）細胞株、人肝癌細胞株HepG和人肝實質細胞株L-02的毒性影響，以及加砷處理后這四種細胞株中水通道蛋白AQP9 mRNA表達水平及蛋白表達水平的變化。方法：采用水溶性四氯唑（WST-8）法測As2O3對四種細胞株的細胞毒活性，實時定量PCR測定As2O3處理后四細胞株中AQP9 mRNA表達水平，免疫印跡法檢測其中AQP9蛋白表達水平。結果 1～64μΜ As2O3能顯著抑制四種細胞株的增殖，且這些變化呈明顯的劑量依賴關系。其中IC50值較高的AsRE和HepG細胞存活率顯著高于IC50值較低的ECV-304和L-02細胞。As2O3處理后AsRE和HepG細胞中AQP9 mRNA表達水平和蛋白表達水平都有明顯下調，而ECV-304和L-02細胞AQP9的表達沒有明顯變化。結論 As2O3對不同敏感性細胞毒性有所不同，水通道蛋白AQP9的表達被As2O3所上調，其可能在砷的毒性發(fā)揮中扮演重要角色。
獲獎情況
- 尚在投稿中。
鑒定結果
- 尚在投稿中。
參考文獻
- 1 Miao ZF, Chang EE, Tsai FY, et al. Increased aquaglyceroporin 9 expression disrupts arsenic resistance in human lung cancer cells. Toxicol In Vitro[J] 2009,23:209-216. 2 Shinkai Y, Sumi D, Toyama T, et al. Role of aquaporin 9 in cellular accumulation of arsenic and its cytotoxicity in primary mouse hepatocytes. Toxicol Appl Pharmacol[J] 2009,237:232-236. 3 horsen M, Di Y, Tangemo C, et al. The MAPK Hog1p modulates Fps1p-dependent arsenite uptake and tolerance in yeast. Mol Biol Cell[J] 2006,17:4400-4410. 4. Abernathy CO, Liu YP, Longfellow D, et al. Arsenic: health effects, mechanisms of actions, and research issues. . Environ Health Perspect[J] 1999,107:593-597. 5 Evens AM, Tallman MS, RB G. The potential of arsenic trioxide in the treatment of malignant disease: past, present, and future. Leuk Res[J] 2004,28. 6 Verkman AS, Mitra AK. Structure and function of aquaporin water channels. Am J Physiol Renal Physiol[J] 2000,278:F13-28.
同類課題研究水平概述
- 當前對砷的毒性及耐受性機制研究主要集中在砷進入和排出細胞的方式與機制研究中。砷的毒性發(fā)揮與其在細胞中砷的蓄積呈明顯的劑量關系，不同的細胞對砷的敏感性是不同的。另外砷作為一種化療藥物在臨床上應用于治療腫瘤，但腫瘤細胞對砷會產(chǎn)生耐受性阻礙其臨床的使用。因此抗砷機制研究對于砷中毒的防治及解決臨床耐藥難題均有重要意義。 國內外對于砷的入胞與出胞機制有許多研究報道，目前AQP9通道蛋白作為一個負責砷進入細胞的通道被國外許多研究報道所證實，如Shinkai等采用甘露醇作為AQP9的競爭性抑制劑處理小鼠肝細胞以及通過siRNA干擾AQP9的表達，發(fā)現(xiàn)都會導致細胞中砷攝入濃度及其毒性的顯著降低，而在HEK293細胞中過量表達AQP9則增加細胞內砷的含量。但在哺乳動物ECV-304及其經(jīng)過誘導的抗砷性ECV-304細胞AQP9的表達還未見報道，用不同濃度砷處理這兩種細胞，以及肝癌細胞HepG2和肝正常細胞L-02后，AQP9的表達差異也未見報道。 當前哺乳動物中砷依賴于AQP9的入胞機制受何種信號途徑的調控迄今為止沒有得到非常明確的解釋。本研究為闡明其調控機制奠定基礎。
