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基本信息
- 項目名稱：
- 青海湖裸鯉低氧誘導(dǎo)因子-1α ODD功能域P550變異研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究通過定點突變青海湖裸鯉HIF-lα上的P550位點氨基酸，利用綠色熒光蛋白作為融合蛋白標(biāo)簽和報告基因的優(yōu)越性，構(gòu)建真核及原核表達載體，探索P550變異對ODD-eGFP融合蛋白穩(wěn)定性和脯氨酸羥化酶羥化活性的影響。加深對青海湖裸鯉HIF-1α ODD功能域P550位點變異的重要性的認(rèn)識，解析青海湖裸鯉HIF-1α P550變異可能是青海湖裸鯉能夠適應(yīng)青海湖低氧特殊高原鹽湖環(huán)境的關(guān)鍵因素之一。
- 詳細(xì)介紹：
- 作為青海湖唯一的一種經(jīng)濟魚類，青海湖裸鯉能夠在低氧環(huán)境下正常生存。低氧誘導(dǎo)因子對裸鯉在低氧環(huán)境生長有重要作用。常氧下低氧誘導(dǎo)因子能夠被脯氨酸羥化酶羥化，其羥化序列表示為LXXLAP，其中X表示任何氨基酸，而P表示脯氨酸羥基接受體。裸鯉的低氧誘導(dǎo)因子HIF-lα，羥化識別序列較為特殊，是已知物種中唯一在該位點發(fā)生突變的，表示為PEMLAP(550-555)，對應(yīng)人的HIF-lα ODD功能域LEMLAP(559-564)。 本研究通過定點突變P550位點的蛋白質(zhì)，探索P550變異對ODD-eGFP融合蛋白穩(wěn)定性和脯氨酸羥化酶羥化活性的影響。首先構(gòu)建ODD(P550)-eGFP與ODD(L550)-eGFP融合蛋白的真核表達載體，利用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測后經(jīng)處理獲得融合蛋白，采用熒光定量PCR和Western blot分別檢測其mRNA和蛋白水平。其次，構(gòu)建pET-30a-ODD(P550)-eGFP及pET-30a-ODD(L550)-eGFP原核表達載體，經(jīng)鎳柱純化得到融合蛋白?？寺「彼崃u化酶2(prolyl hydroxylase 2, PHD2)基因，采用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液體系體外表達獲得PHD2，并以原核表達的融合蛋白為底物進行羥化反應(yīng)，Western blot鑒定兩種融合蛋白羥化水平的差異。研究結(jié)果顯示，低氧下ODD(P550)-eGFP的蛋白水平相比ODD(L550)-eGFP較高，經(jīng)PHD2處理后，ODD(P550)-eGFP融合蛋白的羥化水平無顯著變化，而ODD(L550)-eGFP則發(fā)生遷移率的差異，出現(xiàn)新的條帶，表明青海湖裸鯉ODD功能域HIF-lα P550變異，影響青海湖裸鯉HIF-lα的羥化水平和穩(wěn)定性。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：研究P550變異對HIF-1α穩(wěn)定性和羥化水平的影響，為裸鯉保護和種群恢復(fù)提供依據(jù)，為培育抗逆性強的優(yōu)良魚類新品種提供新思路。 基本思路：定點突變P550位點，構(gòu)建野生及突變型真核表達載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用熒光定量PCR和Western blot檢測其mRNA和蛋白水平。克隆并體外表達PHD2，與原核表達的ODD-eGFP融合蛋白進行羥化反應(yīng)，經(jīng)Western blot分析羥化水平差異。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 本研究首次揭示青海湖裸鯉HIF-1α P550位點變異影響HIF-1α的穩(wěn)定性和羥化水平，為進一步闡明該變異的生理意義及可能存在的逆境適應(yīng)的特殊分子機制提供依據(jù)。同時為魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖和基因工程培育抗逆性強的魚類新品種提供新思路。并采用增強型綠色熒光蛋白標(biāo)記目的基因，在不影響融合蛋白穩(wěn)定性同時，研究因子的相關(guān)特性。首次成功克隆了PHD2基因。從真核表達和原核表達兩條路線出發(fā)闡明P550變異的特殊意義。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本研究為基礎(chǔ)理論研究?？杉由顚η嗪：沲嶩IF-1α ODD功能域P550位點變異的特殊性和重要性認(rèn)識，解析P550變異可能是青海湖裸鯉能夠適應(yīng)青海湖低氧，高寒特殊高原鹽湖環(huán)境的關(guān)鍵因素之一。通過青海湖裸鯉獨特的耐低氧機制的研究，可為更好地應(yīng)對水體低氧影響水產(chǎn)養(yǎng)殖這一難題在理論上提供新思路。為裸鯉保護和種群恢復(fù)提供依據(jù)。同時，也可為通過基因工程培育抗逆性強的優(yōu)良魚類新品種在理論上提供新的思路。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 低氧誘導(dǎo)因子對青海湖裸鯉在低氧環(huán)境生長有重要作用。裸鯉的低氧誘導(dǎo)因子HIF-lα羥化識別序列是已知脊椎動物HIF-lα序列中唯一在P550位點發(fā)生突變的。 本研究通過定點突變P550位點的氨基酸，探索P550變異對ODD-eGFP融合蛋白穩(wěn)定性和脯氨酸羥化酶羥化活性的影響。首先構(gòu)建野生型及突變型融合蛋白的真核表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，采用熒光定量PCR和Western blot分別檢測其mRNA和蛋白水平。其次構(gòu)建野生型及突變型融合蛋白的原核表達載體，表達得融合蛋白?？寺「彼崃u化酶2(PHD2)基因，體外表達獲得PHD2，并以原核表達的融合蛋白為底物進行羥化反應(yīng)，Western blot鑒定兩種融合蛋白羥化水平的差異。結(jié)果顯示，低氧下ODD(P550)-eGFP的蛋白水平相比ODD(L550)-eGFP較高，經(jīng)PHD2處理后，ODD(P550)-eGFP融合蛋白的羥化水平無顯著變化，而ODD(L550)-eGFP則發(fā)生遷移率的差異，出現(xiàn)新的條帶，表明青海湖裸鯉ODD功能域HIF-lα P550變異，影響青海湖裸鯉HIF-lα的羥化水平和穩(wěn)定性。
獲獎情況
- 1.2010年11月，獲浙江省第二屆生命科學(xué)競賽二等獎。 2.2010年12月，獲浙江師范大學(xué)第四屆“挑戰(zhàn)杯”大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽一等獎。
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻
- 1. Western blot [1] Parchi P, Notari S, Weber P, et al. Inter-Laboratory Assessment of PrPSc Typing in Creutzfeldt-Jakob Disease: A Western Blot Study within the NeuroPrion Consortium[J]. Brain Pathol, 2009, 19(3):384-391 2. 熒光定量PCR [1] Benes V, Castoldi M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available[J]. Methods, 2010, 50(4):244-249 3. 重疊延伸PCR [1] W. R. A. Kosala, J. S. Rajapaksha, Daoyi Wang, et al. Novel Splice Variants of Rat CaV2.1 That Lack Much of the Synaptic Protein Interaction Site Are Expressed in Neuroendocrine Cells[J]. J Biol Chem, 2008, 283(13): 15997-16003 4. 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA [1] Wang X J, Han Y X, Dang Y, et al. Moloney Leukemia Virus 10 (MOV10) Protein Inhibits Retrovirus Replication[J]. J Biol Chem, 2010, 285(15):14346-14355
同類課題研究水平概述
- 青海湖裸鯉是青海湖唯一的經(jīng)濟魚類。 近幾十年來，過度捕撈等因素造成其天然產(chǎn)卵場的破壞，導(dǎo)致裸鯉資源急劇下降，已基本喪失漁業(yè)價值。裸鯉的生理或分子適應(yīng)機制尚未得到詳細(xì)闡述。 水體溶氧量變化對魚類生長發(fā)育影響至關(guān)重要。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)為低氧調(diào)控的核心轉(zhuǎn)錄因子。 低氧誘導(dǎo)因子-1 (HIF-1)是低氧誘導(dǎo)因子三種亞型中的一種，屬于一種對氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子超家族。HIF-1 能調(diào)控100多種基因，能根據(jù)低氧的嚴(yán)重程度和細(xì)胞環(huán)境情況，引起靶基因表達量不同程度的增加。 HIF-1由α和β兩個亞基組成，其活性主要由HIF-1α決定。 氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(oxygen-dependent degradation domain, ODD)位于人HIF-1α氨基酸序列401-603 區(qū)域。 低氧下，HIF-1α 保持穩(wěn)定并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與β亞基聚合激活轉(zhuǎn)錄。常氧下，人HIF-1α上的第402和564位脯氨酸殘基被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)羥化，隨后被pVHL蛋白(von Hippe l-Lindau protein)識別，隨后降解。PHD的羥化序列表示為LXXLAP，其中X可為任何氨基酸，而P表示脯氨酸羥基接受體。PHD2是PHDs三種同工酶中的一種。 在已知脊椎動物中，青海湖裸鯉HIF-1α是進化速率最快的HIF-1α基因之一，其羥化識別序列為PEMLAP(550-555)，與人HIF-lα ODD功能域LEMLAP(559-564)相比，第550位由脯氨酸P替換了保守的亮氨酸L，是目前已知HIF-lα序列的所有脊椎動物中，唯一在該位點發(fā)生變異的物種。 Huang 等實驗表明，若人的HIF-lα ODD 功能域LEMLAP(559-564)中L559發(fā)生突變，PHD的識別效率會降低，HIF-lα 較穩(wěn)定。Li 等的研究表明，將L559 突變成P559 會使低氧誘導(dǎo)因子的PHD活性降低至原來的50% 左右。而對青海湖裸鯉相對應(yīng)的該序列上P550位點并未研究。因此，推測青海湖裸鯉的HIF-lα ODD功能域的氨基酸序列P550變異可能影響PHDs對裸鯉HIF-1α的識別與羥化，以及HIF-1α的穩(wěn)定性，從而在青海湖裸鯉對高原鹽湖環(huán)境的適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。
