基本信息
- 項目名稱：
- 用于蛋白間互作研究的雙分子熒光互補（BiFC）操作平臺的構建及應用
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 科技發(fā)明制作A類
- 簡介：
- 雙分子熒光互補是利用綠色熒光蛋白產(chǎn)生的熒光驗證蛋白之間的互作、檢測其互作強弱以及定位蛋白互作位點的一項新技術.本研究針對已有的BiFC載體缺陷進行改造. 同時，將應用改造后載體平臺對番茄CIPKs和CBLs蛋白互作展開研究，結果番茄中CBLs與CIPKs的互作并非與擬南芥完全相同，可能調控不同的抗逆反應，為進一步開展番茄CBLs與CIPKs的功能研究提供線索.
- 詳細介紹：
- 雙分子熒光互補（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是利用綠色熒光蛋白產(chǎn)生的熒光驗證蛋白之間的互作、檢測其互作強弱以及定位蛋白互作位點的一項新技術. 本研究針對已有的BiFC載體構建過程復雜、所用工具酶為稀有酶及連接困難等問題，對BiFC進行改造. 結果表明，改造后的BiFC平臺操作便利、快捷，假陽性出現(xiàn)機率低，可用于蛋白間互作分析. 通過該平臺，進一步開展了番茄CBLs與CIPKs間互作研究，各CBLs與CIPKs組合間均能產(chǎn)生互作，但互作強弱程度差異較大. 特別值得關注的是，擬南芥AtCBL1與AtCIPK23互作可激活鉀離子通道，但LeCBL1和LeCIPK23互作很弱，與預期不符，表明番茄中CBLs與CIPKs的互作并非與擬南芥完全相同，可能調控不同的抗逆反應，為進一步開展番茄CBLs與CIPKs的功能研究提供線索.
作品圖片
作品專業(yè)信息
設計、發(fā)明的目的和基本思路、創(chuàng)新點、技術關鍵和主要技術指標
- 研究目的：本研究旨在擴展雙分子熒光互補（BiFC）技術在植物分子生物學研究中的應用。 基本思路：分別克隆35S 啟動子和終止子，插入到pCAMBIA1301雙元表達載體合適位置，構建pCAMBIA1301-35ST載體；消除pCAMBIA1301-35ST載體中的部分酶切位點；分別以BiFC載體pSAT1-cEYFP-C1-B和pSAT4-nEYFP-C1質粒為模板，克隆相應的cEYFP盒和nEYFP盒，分別構建pCAMBIA1301-cEYFP -35ST和pCAMBIA1301-nEYFP-35ST載體。 創(chuàng)新點：原有的BiFC載體在構建過程中存在克隆過程復雜、所用工具酶為稀有酶，以及不易連接成功等問題，本小組的創(chuàng)新在于對原BiFC載體進行改造，消除原載體上的稀有酶切位點，增加實驗室常用的一些限制酶切位點，便于目的基因進行熒光互補觀察。 技術關鍵：消除pCAMBIA1301-35ST載體中的部分稀有酶切位點；增加實驗室常用的一些限制酶切位點。 主要技術指標：（1）構建pCAMBIA1301-cEYFP -35ST和pCAMBIA1301-nEYFP-35ST載體，用實驗室常用的一些限制酶切位點替代原載體上的稀有酶切位點。
科學性、先進性
- 蛋白質功能的表現(xiàn)通常通過蛋白質的相互作用完成，即某一個蛋白質的功能表型，要通過與其他蛋白質之間的相互作用來實現(xiàn)。蛋白互作是細胞中的一項基本生理作用，發(fā)生在所有亞細胞結構及細胞器中的每一個生理過程。目前，蛋白互作的研究已經(jīng)是研究生命活動的一個熱點方向。免疫共沉淀、表面等離子共振，以及酵母雙雜交技術是較為傳統(tǒng)的蛋白質互作研究手段，但不能有效開展活體研究。 利用熒光蛋白發(fā)光原理可有效檢測蛋白在活體內的互作，現(xiàn)有雙分子熒光蛋白互補 和熒光共振能量轉移 兩種方法。本小組在原有的BiFC技術基礎上，針對其載體克隆過程復雜、所用工具酶為稀有酶，以及不易連接成功等問題開展了一系列的攻關，新的改良載體已經(jīng)成功替換了稀有的工具酶，以常用的工具酶為代替，克服了不易連接成功的問題；同時載體骨架的改變也克服了克隆過程復雜，有利于實驗室后續(xù)研究的進展。
獲獎情況及鑒定結果
- 1. 本項目曾在2010 年參加由浙江省大學生科技競賽委員會主辦的浙江省第二屆大學生生命 科學競賽，并獲得一等獎。 2. 省科技廳2010 年度浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃立項項目“雙分子熒光互補技術研究番 茄CBL1 與CIPK23 的互作”（2010R404005）。 3. 本項目曾獲浙江師范大學第四屆“挑戰(zhàn)杯”課外學術科技作品競賽一等獎。
作品所處階段
- 實驗室階段
技術轉讓方式
- 有償轉讓
作品可展示的形式
- 圖片 樣品
使用說明,技術特點和優(yōu)勢,適應范圍,推廣前景的技術性說明,市場分析,經(jīng)濟效益預測
- 蛋白互作是細胞中的一項基本生理作用，發(fā)生在所有亞細胞結構及細胞器中的每一個生 理過程。闡明蛋白質的相互作用在何時、何地發(fā)生以及蛋白質復合物如何形成，能為確定蛋 白質生物學作用提供決定性線索。目前，蛋白互作的研究已經(jīng)是研究生命活動的一個熱點方 向。 BiFC 技術是近年來發(fā)展的研究目標蛋白是否具有相互作用的一項新技術。與常用的研究 蛋白互作的免疫共沉淀、表面等離子共振、酵母雙雜交技術相比，BiFC 技術簡單直觀，無需 試劑檢測，假陽性率低，從而能更好的推斷出目標蛋白是否發(fā)生了相互作用?，F(xiàn)有研究表明 BiFC 技術能廣泛應用于許多結構、功能不同的蛋白互作與修飾的研究。該技術在不同實驗室 也已廣泛的應用于不同的細胞株與有機體，并未發(fā)現(xiàn)在任何實驗材料系統(tǒng)出現(xiàn)不適用。本實 驗小組開發(fā)的BiFC 改良載體將以載體形式轉讓于其他實驗室，以其改良后的優(yōu)勢逐漸替代原 有BiFC 載體的市場。目前，蛋白互作已成為研究的熱點，因而改良載體具有很好的社會效益。
同類課題研究水平概述
- 下村修等從水母體內分離純化得到綠色熒光蛋白，馬丁·查爾菲等首次在大腸桿菌中成功表達了能夠產(chǎn)生綠色熒光的GFP。 目前，GFP的應用已經(jīng)涉及分子生物學、細胞生物學以及臨床醫(yī)學等多個學科。作為報告基因，GFP被廣泛的應用于亞細胞定位、蛋白互作等諸多體系中，成為重要的研究手段。而蛋白互作是細胞中的一項基本生理作用，利用GFP發(fā)光原理可有效檢測蛋白在活體內的互作，現(xiàn)有雙分子熒光蛋白互補和熒光共振能量轉移兩種方法。 BiFC是基于GFP發(fā)光原理來驗證蛋白之間的互作、檢測其互作強弱以及定位蛋白互作位點的一項新技術。將GFP在特定的位點切開，形成不發(fā)熒光的N端和C端，分別連接到2個有相互作用的靶蛋白，在細胞內共表達或體外混合這2個融合蛋白時，由于靶蛋白的相互作用，熒光蛋白的2個片段在空間上互相靠近互補，重新構建成完整的具有活性的熒光蛋白分子。 現(xiàn)有研究表明BiFC 技術能廣泛應用于許多結構、功能不同的蛋白互作與修飾的研究。該技術在不同實驗室也已廣泛的應用于不同的細胞株與有機體，并未發(fā)現(xiàn)在任何實驗材料系統(tǒng)出現(xiàn)不適用。 BiFC 系統(tǒng)雖然出現(xiàn)較晚，但迅速獲得應用。目前雙分子熒光互補標記技術在蛋白互作研究應用中 主要涉及于轉錄因子間的相互作用及其亞細胞定位，G 蛋白以及α 和β 亞基之間的互相作用，各類蛋白家族以及相關伴侶蛋白之間的互相作用，信號轉導級聯(lián)，酶-底物復合物的確定，蛋白復合物定位調節(jié)，涉及轉錄后修飾的互作，監(jiān)視新的互作蛋白，大分子復合物和分子骨架等 。這些蛋白質在傳統(tǒng)的研究中因為條件的限制曾存在種種猜測和質疑，但隨著BiFC 技術在研究中的應用，各種猜測也漸漸地得到了解決，尤其是蛋白家族以及相關伴侶蛋白之間的互相作用的研究。傳統(tǒng)的研究對于伴侶蛋白的研究一直存在空白，盡管存在種種跡象證明它的存在，但卻沒有一種直接的手段觀察或提取到伴侶蛋白。利用BiFC 技術我們可以直接在熒光顯微鏡下觀察到伴侶蛋白的生物過程，這也有利于我們對蛋白家族或群體協(xié)作的研究。 盡管BiFC 技術仍具有許多難以克服的缺陷，但我們必須承認雙分子熒光互補標記技術已經(jīng)為我們 蛋白質互作的研究打開了新的道路。并且隨著BiFC 技術的完善，更加合適的GFP 變異的出現(xiàn)，蛋白 質互作的研究將會得到更好的發(fā)展。
