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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 牙髓炎疼痛相關(guān)因子CGRP的動(dòng)態(tài)表達(dá)及作用研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 牙髓是富含神經(jīng)纖維的組織，牙髓炎癥在很大程度上屬于神經(jīng)源性所介導(dǎo)的炎癥，神經(jīng)系統(tǒng)在牙髓的炎癥及修復(fù)過程中起著不可低估的作用。 本研究利用大鼠牙髓炎動(dòng)物模型，觀察牙髓炎大鼠半月神經(jīng)節(jié)及牙髓中CGRP的表達(dá)變化，探討CGRP參與牙髓病理改變的信號(hào)調(diào)節(jié)作用，為深入研究神經(jīng)系統(tǒng)參與牙髓的各種生理、病理改變的調(diào)節(jié)提供實(shí)驗(yàn)參考，為進(jìn)一步闡明牙髓炎疼痛機(jī)制、積極開發(fā)牙髓炎防治新靶點(diǎn)提供新的思路和理論依據(jù)。
- 詳細(xì)介紹：
- 一、研究背景： 牙髓炎是口腔臨床常見病癥，陣發(fā)性劇痛為患者就診的最常見主訴。研究表明，牙髓是一種富含神經(jīng)纖維的組織，這些神經(jīng)纖維來源于三叉神經(jīng)節(jié)初級感覺神經(jīng)元，含有P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin Gene-Relatcd Pepide, CGRP)、神經(jīng)激肽A等神經(jīng)肽[1]。有學(xué)者認(rèn)為，神經(jīng)肽可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)與血管的活動(dòng)而參與牙髓急慢性炎癥過程，因此牙髓炎癥在很大程度上是屬于神經(jīng)源性所介導(dǎo)的炎癥[2]。 CGRP主要分布于傳導(dǎo)痛覺的無髓鞘的C神經(jīng)纖維和細(xì)髓鞘的Aδ神經(jīng)纖維，人的恒牙牙髓組織中，其陽性纖維呈束狀進(jìn)入根尖孔，分布于整個(gè)牙髓組織中[3]。CGRP是一種多功能生理調(diào)節(jié)肽，在體內(nèi)作用廣泛。首先，它作為神經(jīng)遞質(zhì)將感覺信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是痛覺和痛覺過敏產(chǎn)生的必需物質(zhì)[4]。此外，CGRP作為舒血管物質(zhì)，具有明顯的血管擴(kuò)張作用。它還可以增強(qiáng)SP的漿液外滲效應(yīng)，對組胺、緩激肽等引起的血管通透性增加有放大效應(yīng)[5-6]。近年來研究表明，感覺傳導(dǎo)神經(jīng)除了將疼痛信息向中樞方向傳導(dǎo)外，還有逆?zhèn)鲗?dǎo)功能，通過神經(jīng)纖維向外周組織釋放CGRP等神經(jīng)活性物質(zhì)，在局部組織中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，牙髓組織中免疫活性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞與CGRP 和SP 神經(jīng)纖維非常接近，并可見細(xì)胞與神經(jīng)末梢膨大處的接觸[7]，提示牙髓細(xì)胞中存在著神經(jīng)與免疫系統(tǒng)的相互作用。因此, 神經(jīng)系統(tǒng)在牙髓的炎癥及修復(fù)過程中起著不可低估的作用。 本實(shí)驗(yàn)利用大鼠牙髓炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yīng)用免疫熒光及免疫組化法觀察牙髓炎大鼠TG神經(jīng)元及牙髓神經(jīng)纖維CGRP的表達(dá)變化，探討疼痛相關(guān)因子CGRP參與牙髓病理改變的信號(hào)調(diào)節(jié)作用，為深入研究神經(jīng)系統(tǒng)參與牙髓的各種生理、病理改變的調(diào)節(jié)提供實(shí)驗(yàn)參考。為進(jìn)一步闡明牙髓炎疼痛機(jī)制、積極開發(fā)牙髓炎防治新靶點(diǎn)提供新的思路和理論依據(jù)。 參考文獻(xiàn)： [1]. 牙髓組織中降鈣素基因相關(guān)肽和P 物質(zhì)的研究現(xiàn)狀，郝作琦等，牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2001;11(5):345-347. [2]. Kim S, Neurovascular interactions in the dental pulp in health and in-flammation, J Endodont, 1990; 16 (2):48. [3]. Egan CA. On the pulpal nerve supply in primary human teeth :evidence for the innervation of primary dentine, Int J Paediatr Dent , 1999; 9 (1) :5 7. [4]. Seybold V.S, The role of peptides in central sensitization, Handb Exp Pharmacol 2009; (194): 451-91. Review [5]. 咬合重建大鼠三叉神經(jīng)節(jié)CGRPmRNA 及其相應(yīng)蛋白的表達(dá)研究，李曉光等, Journal of Oral Science Research, 2010; 3 (26): 312-315. [6]. Le Bars D, Adam F, Nociceptors and mediators in acute inflammatory pain,Ann Fr Anesth Reanim. 2002;21 (4): 315-335, Review. [7]. Okiji T, Jontell M, Belichenko P, et al., Structural and functional association between substance P and Calcitonin gene-related peptide immunoreactive nerves and accessory cells in the rat dental pulp, J Dent Res , 1997; 76 (12) :1818. 二、主要研究內(nèi)容： 1、建立大鼠牙髓炎動(dòng)物模型 髓腔直接暴露及根管內(nèi)封入完全弗氏佐劑（Freund's Adjuvant Complete, CFA，兩種方法建立SD（Sprague-Dawley）大鼠牙髓炎模型。 1.1 髓腔直接暴露法： 麻醉大鼠，消毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，高速渦輪牙鉆（水冷卻下）將右側(cè)下頜第一磨牙牙合面開髓，髓腔自然暴露。 1.2 CFA誘導(dǎo)法： 按髓腔直接暴露法將右側(cè)下頜第一磨牙牙合面開髓，生理鹽水沖洗、吸干后，將浸有CFA液（CFA:生理鹽水，2:1）的棉尖置入髓腔，暫封。 2、應(yīng)用間接免疫熒光法和免疫組化方法檢測CGRP表達(dá) 2.1 標(biāo)本的制備： 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液經(jīng)左心室灌流固定動(dòng)物。剖取TG用相同固定液后固定，20%蔗糖隔夜浸潤后，制備片厚10μm的TG連續(xù)冰凍切片；剖取下頜骨，去除骨表面軟組織，中線處縱行分離，修整為包含第一、二、三磨牙的長方形骨塊，置入4.13％的EDTA磷酸鹽緩沖液中脫礦3周，20%蔗糖隔夜浸潤后，沿骨塊長軸縱行切片制備12μm厚的牙髓冰凍切片。 2.2 間接免疫熒光法及免疫組織化學(xué)染色： 取經(jīng)上述方法處理的一組切片，PBS液清洗后加入含0.3％H2O2的甲醇溶液，室溫下處理30 min固定組織并滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗后滴加正常山羊血清封閉液，室溫下孵育30min。滴加兔抗大鼠CGRP抗體（1:5000），4℃過夜（陰性對照組以等量PBS替代一抗）。PBS清洗后加入CY3標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200），避光孵育1h。PBS漂洗后滴加DAPI（1ug/ml）工作液，細(xì)胞核染色5分鐘，PBS充分漂洗后熒光封片劑封片，Olympus BX-51TF熒光顯微鏡下觀察。 免疫組織化學(xué)染色簡述如下，一抗兔抗大鼠CGRP抗體濃度采用1:10000，SP免疫組化試劑盒代替熒光素標(biāo)記的IgG，硫酸鎳銨葡萄糖氧化酶加強(qiáng)的DAB進(jìn)行顯色，梯度酒精脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，其余過程間接免疫熒光法。 3、應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)及實(shí)時(shí)定量PCR (Quantitative Real-Time PCR,QPCR)方法從mRNA水平檢測CGRP表達(dá)的變化 選取代表性時(shí)間點(diǎn)斷頸法處死動(dòng)物，無菌條件下快速剖取TG，異硫氰酸胍一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈。PCR法擴(kuò)增CGRP分子的目的片斷，產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳。進(jìn)一步應(yīng)用TaqMan 實(shí)時(shí)定量QPCR技術(shù)精確定量各mRNA水平并記錄時(shí)程變化。 三、擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題 1、解析牙髓炎大鼠TG神經(jīng)元及牙髓神經(jīng)纖維CGRP的表達(dá)變化。 2、探討疼痛相關(guān)因子CGRP參與牙髓病理改變的信號(hào)調(diào)節(jié)作用。 3、為深入研究神經(jīng)系統(tǒng)參與牙髓的各種生理、病理改變的調(diào)節(jié)提供實(shí)驗(yàn)參考。 4、為進(jìn)一步闡明牙髓炎疼痛機(jī)制、積極開發(fā)牙髓炎防治新靶點(diǎn)提供新的思路和理論依據(jù)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 目的：觀察牙髓炎大鼠TG及炎癥牙髓中CGRP的分布，深入探討神經(jīng)系統(tǒng)參與牙髓病理改變的信號(hào)調(diào)節(jié)作用。 基本思路：本研究擬構(gòu)建弗氏佐劑誘發(fā)的大鼠牙髓炎動(dòng)物模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR等現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)深入解析疼痛相關(guān)因子CGRP的分子表達(dá)及分布，為進(jìn)一步闡明牙髓炎疼痛機(jī)制、積極開發(fā)牙髓炎防治新靶點(diǎn)提供新的思路和理論依據(jù)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本課題選題新穎，具有口腔醫(yī)學(xué)特色。本研究將從分子水平對疼痛相關(guān)因子在牙髓炎疼痛中的動(dòng)態(tài)角色予以闡明，探討牙髓炎疼痛機(jī)制、發(fā)掘鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)，為深入研究神經(jīng)系統(tǒng)參與牙髓的各種生理、病理改變的調(diào)節(jié)提供實(shí)驗(yàn)參考。本研究結(jié)果可以填補(bǔ)這一研究領(lǐng)域的空白，為急、慢性牙髓炎的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)參考和理論依據(jù)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 牙髓炎癥所誘發(fā)的自發(fā)性疼痛給患者帶來極大的痛苦，然而引起牙痛的病因多樣，疼痛的發(fā)病機(jī)制不清，至今缺乏有效的防治措施。本研究成果將對闡明牙髓炎疼痛機(jī)制、開發(fā)鎮(zhèn)痛分子靶點(diǎn)、完善牙髓炎的臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的：觀察牙髓炎大鼠半月神經(jīng)節(jié)及炎癥牙髓中CGRP的分布，探討神經(jīng)系統(tǒng)參與牙髓病變的信號(hào)調(diào)節(jié)作用。方法：采用完全弗氏佐劑誘導(dǎo)法，建立SD大鼠磨牙牙髓炎模型，應(yīng)用免疫熒光、免疫組織化學(xué)染色法及圖像分析技術(shù)，檢測牙髓炎即刻組及7天組TG和牙髓中 CGRP的表達(dá)。結(jié)果：正常大鼠TG中小型神經(jīng)元及其軸突均表達(dá)CGRP，牙髓中富含CGRP免疫反應(yīng)性神經(jīng)纖維。炎癥刺激后TG神經(jīng)元CGRP表達(dá)增強(qiáng)，隨炎癥發(fā)展而減少。炎癥刺激后牙髓中CGRP陽性神經(jīng)纖維減少，后呈回升趨勢。結(jié)論：牙髓受炎癥刺激時(shí)，TG神經(jīng)元CGRP表達(dá)及牙髓內(nèi)陽性神經(jīng)纖維均有調(diào)控性變化，提示CGRP既與牙髓炎性痛的發(fā)生和中樞調(diào)節(jié)有關(guān)，又參與牙髓組織炎癥及修復(fù)過程。
獲獎(jiǎng)情況
- 2011年四月獲得大連醫(yī)科大學(xué)第五屆大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽三等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 無
參考文獻(xiàn)
- 1、咬合重建大鼠三叉神經(jīng)節(jié)CGRPmRNA 及其相應(yīng)蛋白的表達(dá)研究，李曉光等, Journal of Oral Science Research, 2010; 3 (26): 312-315. 2、Okiji T, Jontell M, Belichenko P, et al., Structural and functional association between substance P and Calcitonin gene-related peptide immunoreactive nerves and accessory cells in the rat dental pulp, J Dent Res , 1997; 76(12) :1818. 3、Egan CA. On the pulpal nerve supply in primary human teeth :evidence for the innervation of primary dentine, Int J Paediatr Dent , 1999; 9 (1) :5 7. 4、牙髓組織中降鈣素基因相關(guān)肽和P物質(zhì)的研究現(xiàn)狀，郝作琦等，牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2001;11(5):345-347. 5、Seybold V.S, The role of peptides in central sensitization, Handb Exp Pharmacol 2009; (194): 451-91. Review
同類課題研究水平概述
- 急、慢性牙髓炎在口腔臨床常見多發(fā)，自發(fā)性劇痛為其主要癥狀及病史。然而，牙髓炎性疼痛發(fā)生的病理生理過程復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制不清，更缺乏有效的防治措施。解析牙髓炎疼痛機(jī)制，積極探索治療靶點(diǎn)，具有重要的科學(xué)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。 目前的研究表明，牙髓是一種富含神經(jīng)纖維的組織，這些神經(jīng)纖維來源于三叉神經(jīng)節(jié)初級感覺神經(jīng)元，含有CGRP、P物質(zhì)(SP) 等神經(jīng)肽。有學(xué)者認(rèn)為神經(jīng)肽可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)與血管的活動(dòng)而參與牙髓急慢性炎癥過程，牙髓炎癥在很大程度上是屬于神經(jīng)源性所介導(dǎo)的炎癥。研究證明，組織炎癥過程中，炎細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)，一方面可引起組織的炎性反應(yīng)，同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞膜合成并釋放前列腺素和白三烯，刺激神經(jīng)末梢使感受器致敏，感受器受到刺激后，產(chǎn)生痛覺的同時(shí)還釋放神經(jīng)肽CGRP等，CGRP又可以作為炎癥介質(zhì)直接參與炎癥反應(yīng)。這兩者相互影響，相互聯(lián)系，從而推動(dòng)疾病一步步向前發(fā)展。 CGRP是一種多功能生理調(diào)節(jié)肽，在體內(nèi)作用廣泛。它除了作為疼痛因子發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)作用外，還作為舒血管物質(zhì)具有明顯的血管擴(kuò)張作用。此外，CGRP還可增強(qiáng)SP的漿液外滲效應(yīng)，對組胺、緩激肽等引起的血管通透性增加有放大效應(yīng)。近年來研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，感覺傳導(dǎo)神經(jīng)除了將疼痛信息向中樞方向傳導(dǎo)外，還有逆?zhèn)鲗?dǎo)功能，通過神經(jīng)纖維向外周組織釋放CGRP，在局部組織中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，牙髓組織中免疫活性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞等與CGRP 和SP 神經(jīng)纖維非常接近，并可見細(xì)胞與神經(jīng)末梢膨大處的接觸，提示牙髓細(xì)胞中存在著神經(jīng)與免疫系統(tǒng)的相互作用。因此, CGRP在組織損傷的炎癥及修復(fù)過程中起著不可低估的作用。 本課題研究擬構(gòu)建弗氏佐劑誘發(fā)的大鼠牙髓炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yīng)用免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR等現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從分子水平觀察牙髓炎大鼠TG神經(jīng)元及牙髓神經(jīng)纖維CGRP的動(dòng)態(tài)表達(dá)及轉(zhuǎn)導(dǎo)，探討疼痛相關(guān)因子CGRP參與牙髓病理改變的可能機(jī)制和信號(hào)調(diào)節(jié)作用，為深入研究神經(jīng)系統(tǒng)參與牙髓的各種生理、病理改變的調(diào)節(jié)提供實(shí)驗(yàn)參考。本研究成果對闡明牙髓炎疼痛機(jī)制、發(fā)掘鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)，改善和有效防治療急、慢性牙髓炎的疼痛癥狀提供提供新的思路和理論依據(jù)具有重要的科學(xué)意義。
