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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 四種臨床應(yīng)用材料對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的毒性研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 體外試驗(yàn)表明，現(xiàn)今臨床口腔修復(fù)合金材料釋放出的金屬離子存在抑制細(xì)胞增殖等毒性作用的缺陷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT比色法測(cè)鎳鉻、鈷鉻、金鈀合金、氧化鋯四種材料吸光度值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。并通過(guò)流式細(xì)胞儀法測(cè)定不同材料浸提液中培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞不同增殖周期時(shí)相的DNA百分含量，計(jì)算細(xì)胞的增殖指數(shù)百分比，最終得出此4種材料的細(xì)胞毒性大小，發(fā)現(xiàn)氧化鋯對(duì)牙齦細(xì)胞損傷最小，很好地解決了合金材料對(duì)牙齦損傷的問(wèn)題。
- 詳細(xì)介紹：
- 鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）作為臨床口腔修復(fù)領(lǐng)域最常用的材料，對(duì)其生物相容性的研究在口腔修復(fù)學(xué)和材料學(xué)中始終占有十分重要的地位。很多研究發(fā)現(xiàn)，合金在口腔中可以析出金屬離子，在戴用含合金修復(fù)體患者的唾液、口腔軟組織(如牙齦、舌刮片)中檢測(cè)到相關(guān)金屬離子濃度升高。體外試驗(yàn)表明，牙科合金釋放出的金屬離子具有降低細(xì)胞代謝、抑制細(xì)胞增殖等毒性作用。本實(shí)驗(yàn)選擇國(guó)內(nèi)十多家加工廠常用的4種德國(guó)進(jìn)口鑄造合金，用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)法和流式細(xì)胞儀測(cè)量法，檢測(cè)并比較其對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞的毒性作用，選出最為優(yōu)越的口腔修復(fù)材料。 本實(shí)驗(yàn)采用材料及試劑為：鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）（Germany），人牙齦成纖維細(xì)胞HGF（ATCC，USA）；96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（NUNC，丹麥）；胰蛋白酶、DMEM（高糖）培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清FBS等均為美國(guó)Thermo Scientific HyClone產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； 無(wú)水乙醇、飽和酚（平衡酚、tris-Hcl）等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 主要儀器和設(shè)備為：酶標(biāo)儀（Thermo electron corporation，USA）；倒置顯微鏡（Nikon，日本）；CO2孵箱（Thermo Lab systems，USA）；低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新），流式細(xì)胞儀（BD，USA）。 具體實(shí)驗(yàn)方法如下: 1.鑄造合金浸提液的制備 將4種合金鑄造成直徑6 mm,高3 mm的圓柱體,每種合金10個(gè)試樣。用蒸餾水超聲波清洗10 min,于高溫高壓(103. 42kPa、121℃)條件下滅菌處理20 min。按細(xì)胞培養(yǎng)液(浸提介質(zhì))與試樣表面積之比為1 ml/cm2的標(biāo)準(zhǔn)在37℃、5% CO2、濕度95%的無(wú)菌條件下浸提72 h作為浸提液。 2 人牙齦成纖維細(xì)胞HGF傳代培養(yǎng) 利用含10%胎牛血清的DMEM，加雙抗（100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素）培養(yǎng)HGF。在CO2孵箱中，在37℃、5% CO2、濕度95%的無(wú)菌條件下培養(yǎng)2-3天，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)液的顏色變化換液, 待培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，細(xì)胞鋪滿瓶底90%后傳代。去掉原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基緩慢清洗培養(yǎng)瓶中細(xì)胞，加1ml胰蛋白酶消化，置于孵箱中1-2min,用等量的培養(yǎng)基中和，并用加液槍吹打，將細(xì)胞吹打下來(lái)。將液體抽取出置于離心管中，以1000r/min離心10min。去掉上清液，加入2ml培養(yǎng)基吹打均勻，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液平均分在兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，再在每個(gè)培養(yǎng)瓶中分別加入2ml培養(yǎng)基，放入CO2孵箱中培養(yǎng)（整個(gè)過(guò)程無(wú)菌操作）。 3 MTT比色法檢測(cè)臨床應(yīng)用材料對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的毒性 將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、鎳鉻合金、金鉑合金組(含89.4%黃金)、鈷鉻合金組、氧化鋯全瓷組,每組6復(fù)孔。每孔內(nèi)分別接種細(xì)胞懸液(密度為3000個(gè)/m1) 100μl，以含10%胎牛血清FBS的DMEM培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照,在37℃、5% CO2、濕度95%條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。用含50%材料浸提液的新鮮培養(yǎng)液交換試管中原培養(yǎng)液,陰性對(duì)照以新鮮培養(yǎng)液交換,陽(yáng)性對(duì)照組加入8 ml/L的苯酚溶液10μl。分別在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至2、4、7 d，每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)溶液,置于37℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后取出,倒出96孔板中的液體，加入DMSO溶解。用酶標(biāo)檢測(cè)儀在492nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度(A)值,并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate, RGR)，公式:RGR=(實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值)×100%。根據(jù)RGR值評(píng)定材料毒性程度級(jí)別。 結(jié)論：MTT實(shí)驗(yàn)方法只是通過(guò)檢測(cè)線粒體的一種酶的活性變化來(lái)評(píng)估材料的細(xì)胞毒性，并不反映細(xì)胞其它功能狀況。從MTT比色法結(jié)果分析，細(xì)胞增殖指數(shù)依次為鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷），氧化鋯組對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的損傷率最小。而鎳鉻合金組在后四組材料浸提液組中對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的損傷率最大，但均比陽(yáng)性對(duì)照組的損傷率小。 4 流式細(xì)胞儀法（FCM）檢測(cè)臨床應(yīng)用材料對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的毒性 取細(xì)胞懸液(密度為1×105個(gè)/ml)3 ml加入45 ml培養(yǎng)瓶中37℃培養(yǎng)72 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入旺盛期。以含50%四種臨床應(yīng)用材料浸提液的新鮮培養(yǎng)液交換瓶?jī)?nèi)液體,陽(yáng)性對(duì)照組加入含300μl飽和酚培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)2d。中止培養(yǎng)。 （1）用無(wú)血清1640培養(yǎng)基清洗2次（瓶?jī)?nèi)細(xì)胞），洗去細(xì)胞碎片。 （2）用胰酶徹底消化（使細(xì)胞分散成單個(gè)，無(wú)細(xì)胞團(tuán)）再用等量的培養(yǎng)基中和，離心（800r/min，5min）。 （3）離心后去除上清液，再用無(wú)血清的1640培養(yǎng)基3ml洗兩次（吹打，離心）。 （4）離心后去除上清液，留500μl 1640培養(yǎng)基用200μl的搶緩慢混勻。 （5）緩慢加5ml的4℃預(yù)冷75%的乙醇，則得到濃度為70%-75%之間的濃度，再用500μl的搶混勻（7次左右）。利用流式細(xì)胞儀試劑盒采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞各增殖周期時(shí)相的DNA百分含量。 細(xì)胞增殖指數(shù)=(S+G2M) /(G0G1+S+G2M)。 結(jié)論：流式細(xì)胞儀法從分子水平評(píng)價(jià)合金的細(xì)胞毒性,鎳鉻合金的增殖指數(shù)最小，對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞HGF的損傷程度最大；而氧化鋯（烤瓷）組的增殖指數(shù)最大對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞HGF的損傷程度最小。 MTT比色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果均提示氧化鋯抑制率最小，而鎳鉻合金的抑制指數(shù)最大；鎳鉻合金的細(xì)胞毒性略大于另三種材料，但均在臨床應(yīng)用的允許范圍內(nèi)。 本實(shí)驗(yàn)的意義在于：現(xiàn)如今合金材料廣泛地用于牙科的冠橋修復(fù)、可摘局部義齒支架和烤瓷牙的基底金屬。但由于其具有潛在的毒性和致癌性，越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)合金的生物相容性提出質(zhì)疑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選擇4種臨床應(yīng)用材料和人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，利用MTT比色法及流式細(xì)胞儀法(FCM)驗(yàn)證并評(píng)價(jià)4種材料的細(xì)胞毒性，證明氧化鋯陶瓷材料對(duì)牙齦細(xì)胞損傷最小，本實(shí)驗(yàn)使體外細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的模擬更趨真實(shí)，試驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確與客觀。有研究表明氧化鋯具有密度高強(qiáng)度高的特點(diǎn)，抗破裂性及破裂后強(qiáng)韌的固化性能，是一種優(yōu)秀的高科技生物材料，生物相容性好，優(yōu)于各種金屬合金，包括黃金。氧化鋯對(duì)牙齦無(wú)刺激、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，很適合應(yīng)用于口腔，避免了金屬在口腔內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)敏、刺激、腐蝕等不良反應(yīng)，彌補(bǔ)了合金材料對(duì)牙齦損傷的缺點(diǎn)，此實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為氧化鋯在口腔修復(fù)應(yīng)用中的安全性提供了可靠的依據(jù)。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）為臨床口腔修復(fù)領(lǐng)域最常用的材料。研究發(fā)現(xiàn)，合金在口腔中可以析出金屬離子，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)表明釋放出的金屬離子具有降低細(xì)胞代謝、抑制細(xì)胞增殖等毒性作用。本實(shí)驗(yàn)選擇4種德國(guó)進(jìn)口鑄造合金，用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)法和流式細(xì)胞儀測(cè)量法，檢測(cè)和比較四種合金對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞的毒性作用，為臨床選擇高安全性鑄造合金提供實(shí)驗(yàn)支持。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯為口腔修復(fù)領(lǐng)域最常用的臨床材料，口腔內(nèi)這4種材料析出的金屬離子直接與牙齦接觸，而用人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行這4種臨床應(yīng)用材料進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)報(bào)道較少見(jiàn)。本研究選擇此4種材料和上述細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，使體外細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的模擬更趨真實(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確與客觀。利用MTT比色法及流式細(xì)胞儀法進(jìn)一步驗(yàn)證來(lái)評(píng)價(jià)4種材料的細(xì)胞毒性，以選擇出臨床更為安全的材料。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 氧化鋯陶瓷材料是目前使用較廣的一種全瓷口腔修復(fù)材料，它具有密度高強(qiáng)度高的特點(diǎn)，具有抗破裂性及破裂后強(qiáng)韌的固化性能。并且它是一種優(yōu)秀的高科技生物材料，生物相容性好，優(yōu)于各種金屬合金，包括黃金。氧化鋯對(duì)牙齦無(wú)刺激、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，很適合應(yīng)用于口腔，避免了金屬在口腔內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)敏、刺激、腐蝕等不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞學(xué)方法在細(xì)胞水平證明了氧化鋯陶瓷材料的優(yōu)越性，為其作為口腔修復(fù)材料提供更廣闊的前景。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法，測(cè)定人牙齦成纖維細(xì)胞在鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）4種臨床應(yīng)用材料的浸提液中培養(yǎng)不同時(shí)間（2、4、7天）的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖率(RGR)；并采用流式細(xì)胞儀法測(cè)定以上四種材料浸提液中培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞不同增殖周期時(shí)相中DNA相對(duì)百分含量，計(jì)算細(xì)胞的增殖指數(shù)百分比。意在檢測(cè)鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）4種臨床應(yīng)用材料的細(xì)胞毒性。通過(guò)上述兩種方法測(cè)定4種合金對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞毒性結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)氧化鋯（烤瓷）對(duì)牙齦細(xì)胞損傷最小，證明其具有良好的生物相容性及安全性等優(yōu)于其他合金的性能，很好地解決了合金材料對(duì)牙齦損傷這一難題，為其作為口腔修復(fù)材料提供了更廣闊的前景。
獲獎(jiǎng)情況
- 本實(shí)驗(yàn)獲得大連醫(yī)科大學(xué)第五屆大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品大賽 二等獎(jiǎng)
鑒定結(jié)果
- 本實(shí)驗(yàn)為作者及合作者獨(dú)立完成，構(gòu)思新穎，實(shí)驗(yàn)精巧，數(shù)據(jù)真實(shí)可信，且具有極強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。
參考文獻(xiàn)
- 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)法和流式細(xì)胞儀測(cè)量法檢測(cè)和比較其對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞的毒性作用 Scott A，Egner W，Gawkrodger DJ，et a1．The national survey of adverse reactions to dental materials in the UK：A preliminary study by the UK Adverse Reactions Reporting Project[J]．Br Dent J，2004，196(8)：471—477． Faccioni F，F(xiàn)ranceschetti P，Cerpelloni M，et a1．In vivo study on metal release from fixed orthodontic appliances and DNA damage in oral mucosa cells[J]．Am J Orthod Dentofacial Orthop，2003，124(6)：687—693 張幗，黃翠，張智星，等．牙本質(zhì)粘結(jié)劑對(duì)人牙髓細(xì)胞毒性的體外研究.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，21：808 吳建紅，文輝，趙剛，等．含關(guān)木通血清對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞增殖周期的影響．醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，26：1134
同類課題研究水平概述
- 從20世紀(jì)90年代起越來(lái)越多學(xué)者根據(jù)材料植入體內(nèi)的不同部位及不同的應(yīng)用目的，選擇不同部位和組織來(lái)源的細(xì)胞作為試驗(yàn)細(xì)胞。鎳鉻合金、鈷鉻合金、金鈀合金、氧化鋯（烤瓷）4種口腔修復(fù)領(lǐng)域最常用的臨床材料，口腔內(nèi)這4種材料析出的金屬離子直接與牙齦接觸，而用人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行這4種臨床應(yīng)用材料進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)報(bào)道較少見(jiàn)。鎳鉻合金廣泛地用于牙科的冠橋修復(fù)、可摘局部義齒支架和烤瓷牙的基底金屬。由于鎳和鎳化合物都有潛在的毒性和致癌性，越來(lái)越多的學(xué)者對(duì)鎳的生物相容性提出質(zhì)疑Faccioni等發(fā)現(xiàn)，在戴固定矯治器的患者頰黏膜中，鎳和鉻的濃度分別是正常人的3.4和2.8倍，金屬濃度和口腔黏膜細(xì)胞活力有明顯的負(fù)相關(guān)。而氧化鋯陶瓷材料是目前使用較廣的一種全瓷口腔修復(fù)材料，它具有密度高強(qiáng)度高的特點(diǎn)，具有抗破裂性及破裂后強(qiáng)韌的固化性能。并且它是一種優(yōu)秀的高科技生物材料，生物相容性好，優(yōu)于各種金屬合金，包括黃金?，F(xiàn)有研究表明氧化鋯對(duì)牙齦無(wú)刺激、無(wú)過(guò)敏反應(yīng)，很適合應(yīng)用于口腔，避免了金屬在口腔內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)敏、刺激、腐蝕等不良反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)基于以上國(guó)內(nèi)外研究成果，利用MTT及流式細(xì)胞儀法，采用以上四種應(yīng)用普遍的臨床口腔修復(fù)應(yīng)用材料對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)探究。
