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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 刺松藻硫酸酯多糖抗血小板聚集及抗血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 刺松藻（Codium Fragile）為藻類植物松藻科的嫩藻體。藻體黑綠色，海綿質(zhì)，幼體被白色。刺松藻性味甘咸寒，中醫(yī)認(rèn)為，具有清熱解毒、消腫利水、驅(qū)蟲(chóng)的功效。用于水腫、小便不利等，并具降血脂、抗凝血，抑菌，免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等多重藥理活性。本實(shí)驗(yàn)從刺松藻體壁中提取刺松藻多糖，從不同角度研究刺松藻硫酸酯多糖抗血小板聚集及抗血栓方面的作用，為進(jìn)一步揭示其抗凝血的規(guī)律，以期對(duì)其臨床應(yīng)用提供依據(jù)
- 詳細(xì)介紹：
- 刺松藻（Codium Fragile）為藻類植物松藻科的嫩藻體，又名鼠尾藻、刺海松、軟軟菜等。藻體黑綠色，海綿質(zhì)，幼體被白色。刺松藻性味甘咸寒，中醫(yī)認(rèn)為，具有清熱解毒、消腫利水、驅(qū)蟲(chóng)的功效。用于水腫、小便不利等，并具降血脂、抗凝血，抑菌，免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等多重藥理活性。本實(shí)驗(yàn)從刺松藻體壁中提取刺松藻多糖，從不同角度研究刺松藻硫酸酯多糖抗血小板聚集及抗血栓方面的作用，為進(jìn)一步揭示其抗凝血的規(guī)律，以期對(duì)其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 1.材料與方法 1.1材料 1.1.1 藥品與試劑 APTT試劑盒、PT試劑盒、TT試劑盒（上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司）、枸櫞酸鈉、阿司匹林、腎上腺素、膠原蛋白（sigma）、二磷酸腺苷（ADP）（Amresco）。 刺松藻硫酸多糖制備：刺松藻2009年4月間采自大連海域，經(jīng)遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王宏偉教授鑒定為Codium fragile。多糖提取采用熱水浸提乙醇沉淀法：新鮮藻體洗凈，勻漿后，按1︰2加入蒸餾水，90°C浸提5h，過(guò)濾，藻渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，減壓濃縮至原體積的1/5，三氯乙酸除蛋白，3 000 r/min離心20min，上清液加入乙醇至終濃度70%，靜置過(guò)夜，離心3 000 r/min，20min，多糖沉淀以少量蒸餾水重懸，冷凍干燥得刺松藻多糖（C. fragile polysaccharides，CFPS），為白色粉末。采用硫酸-苯酚法測(cè)定總糖含量為35.11%，BaCl2-明膠比濁法測(cè)得硫酸根含量為9.02%。 1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭白兔，體重2.5～3.5kg，雌雄不限；昆明小鼠（清潔級(jí)），雌雄各半，6～8周齡，體重(20±2)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 FD-1真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；酶標(biāo)儀：Thermo Election Corporation；LBY-NJ 2 血液凝聚儀(北京普利生科貿(mào)集團(tuán))；離心機(jī)。 1.2 體外抗凝血實(shí)驗(yàn) 新西蘭白兔心臟取血，與抗凝劑枸櫞酸鈉按9﹕1比例混勻，3 000 r/min離心15 min，收集上層。將待測(cè)血漿分成4份，分別與不同濃度多糖藥物的混合血漿測(cè)定凝血活酶時(shí)間（APTT），凝血酶原時(shí)間（PT），凝血酶時(shí)間（TT）。 1.2.1 APTT測(cè)定 取混合血漿(37℃孵育3 min)，取0.1ml加入EP管，加入37℃預(yù)溫5 min的APTT試劑0.1ml混合，37℃孵育5 min后，加入已預(yù)溫的CaCl20.1ml，混合后自動(dòng)記錄血漿凝固時(shí)間，即為待測(cè)血漿的APTT。 1.2.2 PT測(cè)定 取混合血漿(37℃孵育3 min) 0.1ml，加入37℃預(yù)溫5 min的PT試劑0.2ml，混合后自動(dòng)記錄血漿凝固時(shí)間， 即為待測(cè)血漿的PT。 1.2.3 TT測(cè)定 取混合血漿(37℃孵育3 min) 0.2ml于測(cè)試槽中，加入已孵育好的TT試劑0.2ml，混合后自動(dòng)記錄血漿凝固時(shí)間， 即為待測(cè)血漿的TT。 1.2.4 凝血時(shí)間(CT)測(cè)定 凝血時(shí)間檢測(cè)分5組，每組設(shè)6個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每試管先行分別加入生理鹽水、1 mg/mL、2 mg/mL、4mg/mL刺松藻多糖，注射用肝素0.1ml，新西蘭白兔心臟取血，立即加入每試管中0.5ml，記錄凝血時(shí)間。 1.3 血小板聚集實(shí)驗(yàn) 健康新西蘭白兔心臟采動(dòng)脈血，0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)。室溫下1000 r/min，離心10min，收集上清為富血小板血漿(PRP) ； 余液繼續(xù)以3000 r/min 離心15min，上清為制貧血小板血漿（PPP)。用PPP調(diào)PRP血小板計(jì)數(shù)為3×105 /μl。設(shè)陰性對(duì)照組： PRP 200 μl + 生理鹽水10 μl； 陽(yáng)性對(duì)照組： PRP 200 μl + LAS 10 μl；實(shí)驗(yàn)組： PRP 200μl + 刺松藻多糖10μl。37 ℃預(yù)熱2 min 后，加入ADP 10μl (終濃度3μmol/l )啟動(dòng)血小板聚集反應(yīng)，濁度法測(cè)定血小板5 min 最大聚集率，血小板聚集測(cè)定2 h內(nèi)完成，計(jì)算血小板聚集抑制百分率。 血小板聚集抑制率= (陰性對(duì)照組血小板聚集率- 實(shí)驗(yàn)組血小板聚集率)/陰性對(duì)照組血小板聚集率×100% 1.4 體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠血栓形成實(shí)驗(yàn) 膠原蛋白和腎上腺素都是血小板聚集誘導(dǎo)劑小鼠靜脈注射后誘發(fā)體內(nèi)肺栓塞，血栓形成，導(dǎo)致偏癱和死亡。這種實(shí)驗(yàn)是篩選和評(píng)價(jià)潛在血小板纖維蛋白原受體拮抗劑的合適的體內(nèi)模型。 小鼠16只隨機(jī)分為4組，每組4只：模型組(蒸餾水10ml/kg) ，小、中、大三個(gè)劑量組(0.1、0.2、0.4g/kg) 。連續(xù)灌胃7 天，灌胃體積為10ml/kg。末次給藥后1h，尾靜脈注射腎上腺素-膠原蛋白混和液0.05ml/10g體重，觀察小鼠5分鐘內(nèi)死亡率。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件完成數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以表示，組間采用t 檢驗(yàn)判斷均數(shù)差異的顯著性。 2 結(jié)果 2．1 刺松藻多糖體外抗凝血 與空白對(duì)照組比較， 刺松藻硫酸酯的濃度為500μg?mL-1時(shí)， 即可顯著延長(zhǎng)凝血時(shí)間TT、CT 和APTT， 當(dāng)濃度2mg?mL- 1時(shí)， CT明顯延長(zhǎng)， 但PT 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未明顯延長(zhǎng)。 2.1.1 刺松藻多糖對(duì)APTT的影響 刺松藻多糖對(duì)APTT的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺松藻多糖125μg/mL， 250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL體外明顯延長(zhǎng)家兔APTT，差異有顯 著性。 2.1.2 刺松藻多糖對(duì)PT的影響 結(jié)果表明，刺松藻多糖125μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL劑量范圍內(nèi)，有較好的延長(zhǎng)PT作用，呈一定的劑量依賴關(guān)系。 2.1.3 刺松藻多糖對(duì)TT的影響 刺松藻多糖顯著延長(zhǎng)家兔凝血酶時(shí)間TT，濃度大于250μg/mL時(shí)，效果更為顯著( P < 0.001)，呈劑量依賴性。 2.1.4 刺松藻多糖對(duì)家兔凝血時(shí)間的影響 刺松藻多糖各劑量組體外均可明顯延長(zhǎng)家兔CT，有劑量依賴關(guān)系。肝素亦明顯延長(zhǎng)CT。 2.2 刺松藻多糖對(duì)家兔血小板聚集的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺松藻多糖可抑制血小板聚集率，隨多糖濃度增加，血小板聚集率呈明顯下降趨勢(shì)。取對(duì)最大聚集度的抑制率作為參數(shù)，結(jié)果顯示刺松藻多糖呈劑量依賴方式抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用。 2.3刺松藻多糖對(duì)小鼠體內(nèi)血栓的影響 刺松藻硫酸酯多糖對(duì)膠原蛋白-腎上腺素所引起的小鼠體內(nèi)血小板聚集有抑制作用，從而抑制其體內(nèi)血栓的形成，能降低了小鼠5分鐘死亡率。 3 討論 凝血過(guò)程是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜過(guò)程，既可由血管內(nèi)膜損傷激活的“內(nèi)源途徑”引發(fā)；也可由血管外的凝血因子與血液接觸而啟動(dòng)的“外源途徑”引發(fā)，但它們最后都通過(guò)激活凝血因子X(jué)完成凝血過(guò)程。凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間可分別反映內(nèi)凝和外凝系統(tǒng)的功能狀況。本研究采用刺松藻提取出的硫酸酯多糖，分別通過(guò)體內(nèi)體外試驗(yàn)對(duì)其抗凝作用進(jìn)行研究：1.在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)刺松藻多糖在CT、APTT、PT、TT等實(shí)驗(yàn)中具有明顯的抗凝作用且具有劑量依賴性。2.在體內(nèi)試驗(yàn)中刺松藻硫酸酯多糖對(duì)膠原蛋白-腎上腺素所引起的小鼠體內(nèi)血小板聚集有抑制作用，從而抑制其體內(nèi)血栓的形成，降低了小鼠死亡率。因此，刺松藻多糖在對(duì)內(nèi)源性外源性凝血都有明顯的抑制作用。 海洋中有著種類繁多的生物，近年來(lái)隨著對(duì)海洋生物的研究不斷增多，不斷發(fā)現(xiàn)具有同陸生生物相比在某些方面更加有效的海洋生物提取物，尋找出具有高效無(wú)毒低副作用的海洋藥物已成為天然藥物研究的新領(lǐng)域。 海洋生物提取物中多糖類物質(zhì)有著生物活性高，毒副作用小的特點(diǎn)，目前對(duì)多糖的藥理研究，多集中在抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)方面，而對(duì)多糖的抗凝血方面的研究相對(duì)較少。且具有抗凝血多糖來(lái)源主要為動(dòng)物、褐藻、真菌。刺松藻所屬的綠藻門(mén)的研究較少，本實(shí)驗(yàn)中采用的刺松藻多糖，是一種硫酸化多糖；硫酸多糖因其具有較強(qiáng)陰離子性，一般表現(xiàn)為不同程度的抗凝血性，具有明顯的抗凝血活性，有很大潛力開(kāi)發(fā)成抗血栓藥物，然而，若要明確刺松藻多糖的抗凝作用機(jī)制及其藥理作用，尚需深入探究。
作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 目的：提取刺松藻多糖，研究其抗血小板聚集及抗血栓作用，為制造純天然抗凝血藥物臨床應(yīng)用提供依據(jù) 基本思路：本實(shí)驗(yàn)采用熱水浸提-乙醇沉淀法提取刺松藻多糖；體外實(shí)驗(yàn)，家兔心臟采血，觀察刺松藻硫酸酯多糖對(duì)凝血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血激酶時(shí)間、凝血酶時(shí)間的影響；采用紅外比濁法測(cè)定刺松藻多糖對(duì)血小板聚集的影響;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，小鼠體內(nèi)血栓模型，給藥觀察小鼠死亡率。分析其抗血小板聚集及抗血栓形
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 凝血時(shí)間和凝血酶原時(shí)間可分別反映內(nèi)凝和外凝系統(tǒng)的功能狀況。本研究采用刺松藻硫酸酯多糖，分別通過(guò)體內(nèi)體外試驗(yàn)對(duì)其抗凝作用進(jìn)行研究：1,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)刺松藻多糖CT、APTT、PT、TT實(shí)驗(yàn)中具有明顯的抗凝作用且具有劑量依賴性;2,體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)膠原蛋白-腎上腺素引起的血小板聚集有抑制作用，從而抑制其體內(nèi)血栓形成，降低了小鼠死亡率。因此，刺松藻多糖在對(duì)內(nèi)源性外源性凝血都有明顯的抑制作用。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 海洋生物提取物中多糖類物質(zhì)有著生物活性高，毒副作用小的特點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)對(duì)多糖的藥理研究，多集中在抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)方面，而對(duì)多糖的抗凝血方面的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)中采用的刺松藻多糖，是一種硫酸化多糖；硫酸多糖因其具有較強(qiáng)陰離子性，一般表現(xiàn)為不同程度的抗凝血性，具有明顯的抗凝血活性，有很大潛力開(kāi)發(fā)成抗血栓藥物，然而，要明確刺松藻多糖的抗凝作用機(jī)制及其藥理作用,尚需深入探究。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 目的: 研究刺松藻硫酸酯多糖抗血小板聚集及抗血栓形成。方法: 家兔心臟采血，通過(guò)對(duì)凝血指標(biāo): 凝血時(shí)間(CT)、凝血酶原時(shí)間(PT )、活化部分凝血激酶時(shí)間(APTT )、凝血酶時(shí)間(TT ) 的觀察其抗凝血活性的量效性, 研究刺松藻硫酸酯多糖的抗凝血活性；采用紅外比濁法測(cè)定刺松藻多糖對(duì)血小板聚集的影響;小鼠尾靜脈注射膠原蛋白-腎上腺素混合液，造成體內(nèi)血栓模型，給藥觀察小鼠5分鐘內(nèi)死亡率。結(jié)果: 刺松藻多糖能顯著延長(zhǎng)家兔血漿CT、APTT、PT和TT；顯著抑制由二磷酸腺苷（ADP）引起的家兔血小板聚集;顯著降低小鼠5分鐘內(nèi)的血栓致死率。結(jié)論：刺松藻多糖具有抗凝血作用。
獲獎(jiǎng)情況
- 遼寧省大連醫(yī)科大學(xué)
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1] 李熙宜，霍玉書(shū)，陳革.中國(guó)遼東半島40種藥用海藻資源簡(jiǎn)介[J].中國(guó)海洋藥物， 1994 ，13 (3) ：50-54. [2] Marina Ciancia，Irene Quintana ， Mar′?a Isabel Vizcarg¨u′enaga，et al. Polysaccharides from the green seaweeds Codium fragile and C. vermilara with controversial effects on hemostasis[J].Int J Biol Macromol， 2007，41(5)： 641-649. [3] Yasantha Athukorala， Ki-Wan Lee， Se-Kwon Kim，et al. Anticoagulant activity of marine green and brown algae collected from Jeju Island in Korea[J]. Bioresource Technol，2007， 98 (9)：1711-1716. [4] 閆冰，等.海參多糖的生物活性研究概況.藥物實(shí)踐雜志[J].2004， 22(2)： 101-103 [5] A. V. Basanova， I. P. Baskova Vascular–Platelet and Plasma Hemostasis Regulators from Bloodsucking Animals.2002， pp. 143-150 [6] 謝露，黎靜 海帶多糖L01抑制血小板活性與血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用 中國(guó)病理生理雜志 2007， 23 (4) ： 674 - 677 [7] 施松善，翁穎琦等 長(zhǎng)葉蜈蚣藻多糖抗凝血活性的研究 中國(guó)海洋藥物雜志 2008年8月 27（4）：21-23 [8] 徐恒啟，陳克利 國(guó)內(nèi)抗凝血、抗血栓多糖的藥理研究進(jìn)展 生物學(xué)雜志第22 卷第1 期 2005，F(xiàn)eb；22（1）14-16
同類課題研究水平概述
- 全世界的藻類約3萬(wàn)余種，包括紅藻、綠藻和褐藻3大類，其中，褐藻和紅藻已經(jīng)被大規(guī)模的人工養(yǎng)殖和工業(yè)利用，而綠藻則未被廣泛開(kāi)發(fā)和利用，只有部分產(chǎn)量高的綠藻被用作飼料、餌料、肥料等。然而，綠藻卻是種類最多的一類海藻，是藻類植物中最大的一門(mén)，約有350個(gè)屬，7500~8000種。在對(duì)于海藻的活性物質(zhì)的研究中，褐藻以及紅藻較多，其中由褐藻中提取的褐藻硫酸酯多糖的生物活性及作用經(jīng)過(guò)近七十年的研究已經(jīng)十分全面，而對(duì)于綠藻的研究尤其是其抗凝血活性的研究?jī)H從上世紀(jì)八九十年代才開(kāi)始出現(xiàn)。 目前，已發(fā)現(xiàn)多種綠藻多糖具有抗凝血活性。Matsubara等從Codi-cylindricum中提取的多糖表現(xiàn)出了類似肝素的活性，能夠顯著延長(zhǎng)APTT和凝血酶時(shí)間(TT)時(shí)間。Hayakawa等從8種綠藻中提取到8種多糖，全部表現(xiàn)出抗凝血活性，這8種綠藻分屬于松藻屬、石莼屬和礁膜屬，多糖通過(guò)依賴于肝素輔助因子II的途徑抑制凝血酶，其抗凝血作用機(jī)制不同于肝素。松藻Codium dwarkenseBoergs和Codium tomentosum (Huds．)Stackh 的冷水提取物具有抗凝血活性。Ghosh等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)蕨藻Caulerpa racemosa多糖能使APTT和TT值顯著延長(zhǎng)。另外，Kweon也證明松藻屬海藻多糖可顯著延長(zhǎng)活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)時(shí)間。 經(jīng)過(guò)近二十年的研究，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)一些綠藻中提取的多糖的研究取得一定進(jìn)展，得出部分綠藻的主要活性成分，并對(duì)這些成分的作用進(jìn)行初步研究。研究表明綠藻的活性成分主要為硫酸阿拉伯聚糖或硫酸鼠李聚糖。其作用機(jī)制主要是通過(guò)加強(qiáng)抗凝血酶Ⅲ和肝素輔助因子Ⅱ起作用，或者直接抑制凝血酶活性和纖維蛋白聚合，是重要的內(nèi)生抑制劑。但是綠藻多糖抗凝血活性會(huì)受到各方面影響，環(huán)境溫度，品種，以及提取方式等。而目前對(duì)綠藻中多糖研究的文獻(xiàn)較少，提取方式不同其作用的成分也不盡相同。 刺松藻屬綠藻門(mén)松藻屬，目前有關(guān)刺松藻的研究在國(guó)內(nèi)較少，其抗凝血的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。有關(guān)動(dòng)物體內(nèi)體外的研究方法在其他藻類多糖的研究中也少見(jiàn)報(bào)道。
