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基本信息
- 項目名稱：
- 應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選龍須菜熱激信號傳導(dǎo)途徑的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 龍須菜是一種重要產(chǎn)瓊膠海藻，已成為我國第三大海藻栽培物種。選育龍須菜耐高溫品種和研究其耐高溫機制一直是研究者迫切需要解決的問題。很多研究表明鈣調(diào)素相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)植物適應(yīng)熱激和耐熱性的反應(yīng)，而CaM結(jié)合蛋白是探明其機制的關(guān)鍵。本作品應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選龍須菜熱激信號傳導(dǎo)的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，為闡明龍須菜熱激信號傳導(dǎo)的鈣調(diào)素途徑奠定基礎(chǔ)，對于選育耐高溫品系，應(yīng)對海水溫度升高帶來的不利影響具有重要意義。
- 詳細介紹：
- 海藻栽培業(yè)是我國海水養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，它直接受到養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境變化的影響。近年來由于溫室效應(yīng)引起的全球溫度升高、人類活動的影響等，導(dǎo)致海水溫度升高，在高溫脅迫下，海藻各種生理代謝過程都會受到影響，嚴重的甚至干擾海藻的正常生長、發(fā)育，進而導(dǎo)致腐爛死亡。 很多研究表明鈣調(diào)素（CaM）相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)植物適應(yīng)熱激和耐熱性的反應(yīng),由于CaM本身并無酶功能，所以不能直接調(diào)節(jié)生理生化過程，因此在CaM信號傳導(dǎo)鏈中鈣調(diào)素的下游必然存在能被鈣調(diào)素調(diào)控的酶蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白，才能完成相應(yīng)的生理生化反應(yīng)。CaM結(jié)合蛋白（CaM-binding proteins，CaMBPs）作為鈣調(diào)素直接結(jié)合和作用的靶蛋白，是CaM信號傳導(dǎo)鏈中的重要組成因子。因此，研究CaMBPs有助于探明CaM信號傳導(dǎo)鏈的作用機制。 在藻類中，關(guān)于CaM信號系統(tǒng)的研究目前非常少，而藻類熱應(yīng)激過程中CaM結(jié)合蛋白的分離和篩選目前尚未見報道。 龍須菜（Gracilaria lemaneiformis Bory）屬紅藻門(Rhodophyta)、江蘺屬(Gracilaria)，產(chǎn)于山東沿海，是一種重要產(chǎn)瓊膠海藻。瓊膠是食品、化工和醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)不可缺少的原料，目前還不能人工合成，只能從龍須菜中提取。龍須菜栽培業(yè)在本世紀(jì)取得了長足發(fā)展，已成為我國繼海帶和紫菜之后的第三大海藻栽培物種。但是野生型龍須菜只能在11-23°C生長繁殖，栽培期短。耐高溫品種981栽培期延長，但夏季在南方長勢差，易發(fā)病，需要移植到北方度夏。選育龍須菜耐高溫品種和研究其耐高溫機制成為研究者迫切需要解決的問題。 本作品應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選龍須菜熱激信號傳導(dǎo)的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，為闡明龍須菜熱激信號傳導(dǎo)的鈣調(diào)素途徑奠定基礎(chǔ)，對于選育耐高溫品系，應(yīng)對海水溫度升高帶來的不利影響具有重要意義。 提取高溫脅迫下的龍須菜mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，構(gòu)建pGADT7-cDNA AD文庫質(zhì)粒導(dǎo)入Y187酵母菌菌株；PCR擴增龍須菜鈣調(diào)素（CaM）的開放閱讀框，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CAM BD，測序正確后導(dǎo)入Y2H Gold酵母菌株。實驗結(jié)果表明二者表達產(chǎn)物對酵母均無毒性作用，且對報告基因均無自激活作用。將酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA與酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM進行交配轉(zhuǎn)化，在SD/–Trp/-Leu/Aba/X-α-Gal平板上篩選陽性克隆，選取200個藍色陽性克隆PCR后測序，比對編碼框正確克隆的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其主要為蛋白酶或分子伴侶。選取180號克隆CaMBP180，克隆并拼接得到其 cDNA序列全長，編碼540個氨基酸，含完整的myo-inositol 1-phosphate synthase（肌醇1-磷酸合成酶，MIPS）結(jié)構(gòu)域，推測其為龍須菜的MIPS，在龍須菜熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中將通過與鈣調(diào)素結(jié)合來調(diào)控細胞對熱刺激的應(yīng)答。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本作品在克隆得到龍須菜鈣調(diào)素cDNA全長序列的基礎(chǔ)上，應(yīng)用酵母雙雜交統(tǒng)篩選龍須熱激信號傳導(dǎo)途徑的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白。為研究龍須菜熱激信號傳導(dǎo)途徑，從分子水平闡明龍須菜對高溫脅迫的響應(yīng)機制奠定基礎(chǔ)。
科學(xué)性、先進性及獨特之處
- 鈣調(diào)素（CaM）相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)植物適應(yīng)熱激和耐熱性的反應(yīng),研究CaMBPs有助于探明CaM信號傳導(dǎo)鏈的作用機制。在藻類中，關(guān)于CaM信號系統(tǒng)的研究目前非常少，尤其是藻類熱應(yīng)激過程中CaM結(jié)合蛋白的分離和篩選目前尚未見報道。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本作品研究海藻的高溫脅迫響應(yīng)機制，對于選育耐高溫品系，應(yīng)對海水溫度升高帶來的不利影響具有重要意義。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 提取高溫脅迫下的龍須菜mRNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，構(gòu)建pGADT7-cDNA AD文庫質(zhì)粒導(dǎo)入Y187酵母菌菌株；PCR擴增龍須菜鈣調(diào)素（CaM）的開放閱讀框，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CAM BD，測序正確后導(dǎo)入Y2H Gold酵母菌株。實驗結(jié)果表明二者表達產(chǎn)物對酵母均無毒性作用，且對報告基因均無自激活作用。將酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA與酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM進行交配轉(zhuǎn)化，在SD/–Trp/-Leu/Aba/X-α-Gal平板上篩選陽性克隆，選取200個藍色陽性克隆PCR后測序，比對編碼框正確克隆的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其主要為蛋白酶或分子伴侶。選取180號克隆CaMBP180，克隆并拼接得到其 cDNA序列全長，編碼540個氨基酸，含完整的myo-inositol 1-phosphate synthase（肌醇1-磷酸合成酶，MIPS）結(jié)構(gòu)域，推測其為龍須菜的MIPS，在龍須菜熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中將通過與鈣調(diào)素結(jié)合來調(diào)控細胞對熱刺激的應(yīng)答。
獲獎情況
- Screening of calmodulin-binding proteins of Gracilaria lemaneiformis under heat stress in signal-transduction by Yeast Two-hybrid System. Journal of Phycology (In press)
鑒定結(jié)果
- 我們篩選到的主要為蛋白酶，包括MIPS、cysteine protease、citroyl synthetase/過氧化物酶及酪氨酸磷酸酶等，與文獻中CaMs作用原理基本一致。MIPS首次發(fā)現(xiàn)并驗證。
參考文獻
- 技術(shù)：酵母雙雜交系統(tǒng) 生物技術(shù) 參考文獻： [1]Thomas A., DEFALCO, Kyle W., BENDER, Wayne A., SNEDDEN. Breaking the code: Ca2+ sensors in plant signaling.Biochem. J.2010, 425: 27–40. [2]Min Chul Kim1, Woo Sik Chung, Dae-Jin Yun, Moo Je Cho. Calcium and calmodulin-mediated regulation of gene expression in plants.Molecular Plant.2009,2(1 ): 13–21. [3] Shen X. C., Alexander Valencia C., Szostak J. W., Dong B., Liu R. H. Scanning the human proteome for calmodulin-binding proteins. Proc. Nat1. Acad. Sci. USA. 2005, 102(17): 5969-5974. [4]Kim,H.S.,et al. Identication of a calmodulin-binding NAC protein as a transcriptional repressor in Arabidopsis. J.Biol.Chem. 2007,282:36292–36302. [5] Liu HT, Li GL, Chang H, Sun DY, Zhou RG, Li B. Calmodulin-binding protein phosphatase PP7 is involved in thermotolerance in Arabidopsis. Plant Cell Environ. 2007, 30(2): 156-164. [6] 李冰, 周人綱. 鈣-鈣調(diào)素信號系統(tǒng)參與熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究. 西北植物學(xué)報. 2004, 24(7): 1322-1328. [7] 毛國紅, 宋林霞, 孫大業(yè). 植物鈣調(diào)素結(jié)合蛋白研究進展. 植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報. 2004, 30(5): 481-488.
同類課題研究水平概述
- 很多研究表明鈣調(diào)素（CaM）相關(guān)蛋白參與調(diào)節(jié)植物適應(yīng)熱激和耐熱性的反應(yīng),由于CaM本身并無酶功能，所以不能直接調(diào)節(jié)生理生化過程，因此在CaM信號傳導(dǎo)鏈中鈣調(diào)素的下游必然存在能被鈣調(diào)素調(diào)控的酶蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白，才能完成相應(yīng)的生理生化反應(yīng)。CaM結(jié)合蛋白（CaMBPs）作為鈣調(diào)素直接結(jié)合和作用的靶蛋白，是CaM信號傳導(dǎo)鏈中的重要組成因子。因此，研究CaMBPs有助于探明CaM信號傳導(dǎo)鏈的作用機制。 從80年代末開始，許多實驗室都試圖分離植物CaMBP基因，使用了很多不同方法包括蛋白純化、抗體篩選文庫、酵母雙雜交分析、蛋白芯片篩查以及凝膠阻滯分析等。在植物體中已經(jīng)分離和鑒定了的CaMBPs包括NADKase，Ca2+ -ATPase，核內(nèi)NTPase等，但是目前分離到的CaMBPs大多是與植物生長發(fā)育相關(guān)的，而與熱激相關(guān)的CaMBPs并不多。Liu等2007年從擬南芥中分離了磷酸酶PP7，采用酵母雙雜交檢測PP7蛋白能夠與CaM結(jié)合，并且能與HSF相互作用，敲除PP7基因的擬南芥耐熱性能明顯下降。 在藻類中，關(guān)于CaM信號系統(tǒng)的研究目前非常少，僅見萊茵衣藻（No. M20729）、團藻（No. X97199）、條斑紫菜（No. EF375999、EF368215）、海帶（No. AB299381）、巨藻（No. X85091）、念珠藻（No. AY064400）等一些藻類中報道了CaM的cDNA序列，念珠藻葛仙米中研究了Ca2+-CaM在藻殖段分化過程中的作用，茅云翔等克隆了條斑紫菜中的CaM序列，并研究了其在失水脅迫下的表達情況。而藻類熱應(yīng)激過程中CaM結(jié)合蛋白的分離和篩選目前尚未見報道。 龍須菜是一種重要產(chǎn)瓊膠海藻。瓊膠是食品、化工和醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)不可缺少的原料，目前還不能人工合成，只能從龍須菜中提取。龍須菜已成為我國繼海帶和紫菜之后的第三大海藻栽培物種。但是野生型龍須菜只能在11-23°C生長繁殖，栽培期短。耐高溫品種981栽培期延長，但夏季在南方長勢差，易發(fā)病，需要移植到北方度夏。選育龍須菜耐高溫品種和研究其耐高溫機制成為研究者迫切需要解決的問題。 本作品應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選龍須菜熱激信號傳導(dǎo)的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，為闡明龍須菜熱激信號傳導(dǎo)的鈣調(diào)素途徑奠定基礎(chǔ)，對于選育耐高溫品系，應(yīng)對海水溫度升高帶來的不利影響具有重要意義。
