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基本信息
- 項目名稱：
- SOE PCR重構(gòu)SLA-I復(fù)合體的研究
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 作品介紹了一種利用SOE PCR方法在體外重構(gòu)SLA-I復(fù)合體的研究。豬SLA-I類分子在體內(nèi)由重鏈和輕鏈以非共價鍵構(gòu)成。本研究擬在體外將SLA-I重鏈基因SLA-2和輕鏈基因β2m重構(gòu)，并在pMAL-p2X系統(tǒng)上表達(dá)。結(jié)果顯示，利用SOE PCR技術(shù)成功構(gòu)建了復(fù)合體基因鏈SLA-2-(G4S)3-β2m，并在pMAL-p2X系統(tǒng)成功表達(dá)。本研究為今后在體外進(jìn)行相關(guān)基因重組表達(dá)提供參考。
- 詳細(xì)介紹：
- 豬的SLA-I類分子由重鏈由重鏈分子和輕鏈β2m構(gòu)成。豬SLA-I重鏈有3個功能基因座，分別稱為SLA-1 (PD1)，SLA-2 (PD14)和SLA-3 (PD7)。而輕鏈只有β2m基因編碼，在體內(nèi)與重鏈以非共價鍵結(jié)合，并起到支持和穩(wěn)定重鏈結(jié)合抗原多肽表位的作用。如何在體外研究豬SLA-I重鏈，輕鏈和多肽表位的結(jié)合是一個值得探討的問題。為此，需要在體外重構(gòu)SLA-I類分子復(fù)合體。 剪接重疊延伸PCR(splicing overlap extension polymerase chain reaction, SOE PCR)技術(shù)由Horton于1989年首先發(fā)明，并且和之前Mullis發(fā)明的PCR技術(shù)相結(jié)合，旨在體外連接兩個功能相關(guān)基因成一個復(fù)合體基因鏈的技術(shù)。 本研究擬利用SOE PCR技術(shù)，中間加一富含甘氨酸/絲氨酸的linker (G4S)3，將SLA-I重鏈基因SLA-2和輕鏈基因β2m連接，形成復(fù)合體基因鏈SLA-2-(G4S)3-β2m，然后將復(fù)合體基因鏈克隆入p2X表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入受體菌TB1并進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果顯示，利用SOE PCR技術(shù)成功得到了復(fù)合體基因鏈SLA-2-(G4S)3-β2m，并且克隆入p2X載體。SDS-PAGE檢測表明，復(fù)合體基因?qū)胨拗骶螳@得了融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m，大小為84.1ku。本研究為今后在體外進(jìn)行相關(guān)基因。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 作品目的：研究SOE PCR的條件；構(gòu)建豬SLA-I復(fù)合體并進(jìn)行表達(dá) 基本思路：利用SOE PCR技術(shù)，中間加一富含甘氨酸/絲氨酸的linker (G4S)3，將SLA-I重鏈基因SLA-2和輕鏈基因β2m連接，形成復(fù)合體基因鏈SLA-2-(G4S)3-β2m，然后將復(fù)合體基因鏈克隆入p2X表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入受體菌TB1并進(jìn)行表達(dá)。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨特之處
- 本作品利用SOE PCR技術(shù)將SLA-2重鏈基因和β2m輕鏈基因中間通過柔性接頭Linker在體外進(jìn)行重組，并對其SOE PCR條件進(jìn)行優(yōu)化，最后成功在pMAL-p2X系統(tǒng)表達(dá)，實現(xiàn)了兩個基因的重組和表達(dá)。該作品的研究方法具有明顯的科學(xué)性，其研究技術(shù)手段目前對于兩個相關(guān)功能基因相互作用規(guī)律的研究仍然具有重要的參考價值。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本研究一方面在體外通過SOE PCR技術(shù)構(gòu)建了豬SLA-I類的復(fù)合體，為今后進(jìn)行SLA-I體外多肽結(jié)合等功能研究奠定了基礎(chǔ)，另一方面也對SOE PCR的擴(kuò)增有關(guān)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為今后進(jìn)行其他相關(guān)基因的研究提供了新的數(shù)據(jù)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 利用SOE PCR技術(shù)，中間加一富含甘氨酸/絲氨酸的linker (G4S)3，將SLA-I重鏈基因SLA-2和輕鏈基因β2m連接，形成復(fù)合體基因鏈SLA-2-(G4S)3-β2m，然后將復(fù)合體基因鏈克隆入p2X表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入受體菌TB1并進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果顯示，利用SOE PCR技術(shù)成功得到了復(fù)合體基因鏈SLA-2-(G4S)3-β2m，并且克隆入p2X載體。SDS-PAGE檢測表明，復(fù)合體基因?qū)胨拗骶螳@得了融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m，大小為84.1kDa。本研究為今后在體外進(jìn)行相關(guān)基因重組表達(dá)提供參考。
獲獎情況
- 作品：SOE PCR重構(gòu)SLA-I復(fù)合體的研究.在2010年09月31日發(fā)表于全國中文核心期刊《動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2010,31（9）:58-62
鑒定結(jié)果
- 經(jīng)大連大學(xué)團(tuán)委和素質(zhì)教育基地等有關(guān)部門鑒定，論文發(fā)表情況屬實。在2010年09月31日發(fā)表于全國中文核心期刊《動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2010,31（9）:58-62
參考文獻(xiàn)
- [1] Horton R, Hunt H, Ho SN, Pullen JK, Pease LR. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension[J]. Gene, 1989;77(1):61-8. [2] Mullis K, Faloona F, Scharf S, et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction[M]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1986;51 Pt 1:263-73. [3] Wiseman R, Karl J, Bimber B, et al. Major histocompatibility complex genotyping with massively parallel pyrosequencing[J]. Nat Med, 2009;15(11):1322-6. [4] Malkki M, Gooley T, Horowitz M, et al. MHC class I, II, and III microsatellite marker matching and survival in unrelated donor hematopoietic cell transplantation[J]. Tissue Antigens, 2007;69 Suppl 1:46-9. [5] Lunney J, Ho C, Wysocki M, et al. Molecular genetics of the swine major histocompatibility complex, the SLA complex[J]. Dev Comp Immunol, 2009;33(3):362-74. [6] 高鳳山, 姜平, 方青美,等. 重構(gòu)豬SLA-I單鏈復(fù)合體及其口蹄疫病毒VP1蛋白限制性表位的篩選[J]. 自然科學(xué)進(jìn)展, 2007;17(6):724-30.
同類課題研究水平概述
- SOE PCR可以把兩個相關(guān)的基因通過一個富含甘氨酸/絲氨酸的Linker (G4S)3連接在一起，從而可以非常方便的研究兩個相關(guān)基因之間的作用和功能。該Linker中，甘氨酸是最簡單的氨基酸，由于甘氨酸缺少側(cè)鏈（只有一個H），因此β轉(zhuǎn)角中能很好調(diào)整其它殘基的空間，不易產(chǎn)生碰撞，可用于調(diào)節(jié)β片層的扭曲和曲度，基本上不影響β折疊片的結(jié)構(gòu)；絲氨酸則常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)角或無序結(jié)構(gòu)。二者組成的接頭僅有3.5nm的跨度，不會在折疊過程中形成二級結(jié)構(gòu)，從而不會影響表達(dá)蛋白的正確折疊及蛋白功能的發(fā)揮。Gao等最近報道了在體外通過SOE PCR技術(shù)構(gòu)建SLA-I復(fù)合體，并通過表達(dá)及多肽結(jié)合研究證明構(gòu)建的復(fù)合體可以用于體外結(jié)合多肽研究。Jeong等也報道了利用SOE PCR技術(shù)來構(gòu)建乳酸菌帶有綠色熒光蛋白的表達(dá)載體。本研究是參考以上研究，并細(xì)化SOE PCR的每一步驟，包括中間過程循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化等，得到循環(huán)次數(shù)為18的最佳條件，這個與報道的循環(huán)次數(shù)為16稍有差別，從而為今后進(jìn)行其他相關(guān)基因的研究提供了參考依據(jù)。 原核表達(dá)系pMAL/p2X是一種可溶性表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有Ptac強(qiáng)啟動子，表達(dá)編碼MBP的malE基因。外源基因插入到malE的下游，與MBP以融合蛋白的形式表達(dá)。在MBP前的信號肽介導(dǎo)融合蛋白到細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá)，這樣便于形成二硫健和蛋白的正確的折疊，特別適用于分泌性蛋白如MHC的表達(dá)，有助于蛋白保持正確的構(gòu)象。在malE和多克隆位點之間，有一個被蛋白酶Factor Xa因子識別的氨基酸序列，Ile-Glu-Gly-Arg，可以把MBP和目的蛋白切割分離。本試驗通過誘導(dǎo)表達(dá)，成功獲得了復(fù)合體基因的融合表達(dá)蛋白，從而豐富了體外構(gòu)建SLA-I復(fù)合體的資料，為今后開展該復(fù)合體結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
