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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 豬β2m在pMAL-p2X系統(tǒng)的表達(dá)和純化
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 本作品介紹了一種在可溶性原核表達(dá)載體系統(tǒng)pMAL-p2X表達(dá)和純化豬β2m蛋白的方法。作品從pH值、溫度、菌體密度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等方面對(duì)豬β2m在pMAL-p2X的表達(dá)條件進(jìn)行了詳細(xì)研究，并在獲得最佳表達(dá)條件的情況下對(duì)β2m進(jìn)行純化。研究結(jié)果顯示在最佳表達(dá)條件下，β2m的相對(duì)表達(dá)含量可達(dá)到45%，純化后的融合蛋白純度達(dá)到90%以上。本研究為今后開展豬β2m進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。
- 詳細(xì)介紹：
- pMAL-p2X系統(tǒng)是一種可溶性原核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)載體上含有表達(dá)麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP，42.5ku)的malE基因，該基因可以誘導(dǎo)外源蛋白至細(xì)胞周質(zhì)中，并以融合蛋白的形式分泌性表達(dá)至培養(yǎng)基上清中，因此非常適合于β2m之類的膜外蛋白的表達(dá)(Gao等, 2009)。在對(duì)β2m進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能的研究中，需要大量的表達(dá)純化蛋白。本研究中，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分別從pH值、溫度、菌體密度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。表達(dá)蛋白經(jīng)過(guò)Amylose樹脂柱進(jìn)行純化。結(jié)果顯示：β2m在pMAL-p2X的最佳表達(dá)條件為pH=7.5、T(溫度)=37℃、OD600=0.3、IPTG=0.5mmol/L和t (誘導(dǎo)時(shí)間)=5h。在最佳表達(dá)條件下β2m的相對(duì)表達(dá)含量可達(dá)到45%。純化后的融合蛋白純度達(dá)到90%以上。β2m基因在pMAL-p2X表達(dá)條件的優(yōu)化及純化為今后進(jìn)一步研究β2m晶體結(jié)構(gòu)和相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 豬β2m蛋白的結(jié)構(gòu)仍然未解析，其相關(guān)功能有待于進(jìn)一步研究。為研究β2m蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，需要準(zhǔn)備大量的表達(dá)蛋白，并進(jìn)行純化。該作品研究了豬β2m蛋白在pMAL-p2X中的表達(dá)條件并對(duì)蛋白進(jìn)行了純化，為今后進(jìn)行β2m蛋白的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。基本思路是β2m重組質(zhì)粒鑒定,然后是β2m在pMAL/p2X上最佳表達(dá)條件的篩選,最后是β2m在pMAL/p2X上的純化.
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 該作品從涉及目的蛋白表達(dá)的pH值、溫度、菌體密度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，并得到各個(gè)條件下的最佳表達(dá)條件，并且在最佳表達(dá)條件下蛋白的相對(duì)表達(dá)含量和純化蛋白。作品設(shè)計(jì)科學(xué)合理，對(duì)于研究其他蛋白的表達(dá)條件和蛋白的純化具有借鑒意義。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 該作品提供了一種研究蛋白在可溶性表達(dá)體系pMAL-p2X中優(yōu)化表達(dá)的方法，同時(shí)該方法也可適用于任何表達(dá)體系，也適用于研究任何表達(dá)蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 為優(yōu)化β2m在pMAL-p2X的表達(dá)。方法：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分別從pH值、溫度、菌體密度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。表達(dá)蛋白經(jīng)過(guò)Amylose樹脂柱進(jìn)行純化。結(jié)果:β2m在pMAL-p2X的最佳表達(dá)條件為pH=7.5、T(溫度)=37℃、OD600=0.3、IPTG=0.5mmol/L和t (誘導(dǎo)時(shí)間)=5h。在最佳表達(dá)條件下β2m的相對(duì)表達(dá)含量可達(dá)到45%。純化后的融合蛋白純度達(dá)到90%以上。結(jié)論：β2m在pMAL-p2X系統(tǒng)表的表達(dá)和純化為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和功能提供數(shù)據(jù)。
獲獎(jiǎng)情況
- 該作品已經(jīng)被全國(guó)中文核心期刊《中國(guó)畜牧獸醫(yī)》正式接受，預(yù)計(jì)發(fā)表于2011年第五期。
鑒定結(jié)果
- 經(jīng)大連大學(xué)團(tuán)委和素質(zhì)教育基地等有關(guān)部門鑒定，論文發(fā)表情況屬實(shí)。該論文已經(jīng)被全國(guó)核心期刊《中國(guó)畜牧獸醫(yī)》接受，并發(fā)表于2011年5月份。
參考文獻(xiàn)
- [1]廖俊偉，張小飛，黃顯明，等. I型鴨肝炎病毒VP3基因的克隆與原核表達(dá) [J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 30(7):49-52. [2]高鳳山等. 大腸桿菌表達(dá)的重組豬β2微球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色譜分析[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2009, 49(2):1596-600. [3]付薇等. 豬鏈球菌9型cps9G基因的克隆與序列分析[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009, (1):1-4.
同類課題研究水平概述
- 豬β2m屬于豬主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)I類分子的輕鏈分子，與重鏈分子非共價(jià)鍵結(jié)合形成MHC I類分子(Wang等, 2009)。豬β2m于1993年要由Milland首次測(cè)定了核酸序列(Milland等, 1993)，Rogel-Gaillard后來(lái)將其定位于1號(hào)染色體q17(Rogel-Gaillard等, 1997)。為研究豬β2m的結(jié)構(gòu)和功能，高鳳山等最近克隆豬β2m基因，并在pMAL-p2X載體上進(jìn)行了表達(dá)和二級(jí)結(jié)構(gòu)研究(高鳳山等, 2009)。然而，到目前為止，豬β2m在pMAL-p2X系統(tǒng)上的最適表達(dá)條件未進(jìn)行研究。 開展β2m進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)和功能的研究需要大量性狀良好的純化蛋白，本研究是在已有研究基礎(chǔ)上，對(duì)β2m蛋白在pMAL-p2X進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)條件的優(yōu)化，以得到β2m蛋白在pMAL/p2X上的最佳表達(dá)條件，并在此基礎(chǔ)上純化為今后研究β2m的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。
