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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- HMGB1對(duì)HTVL-1病毒Tax蛋白表達(dá)的T細(xì)胞中NF-κB活性的影響
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 為了研究作為重要炎癥因子的高遷移率組蛋白（HMGB1）是否與成人T淋巴細(xì)胞白血病（ATL）的發(fā)病有關(guān)，我們構(gòu)建了HMGB1的真核表達(dá)載體，并研究其與Tax蛋白及NF-κB的活性之間的關(guān)系，以期以新的思路為ATL的發(fā)病甚至臨床檢測(cè)治療提供理論依據(jù)。
- 詳細(xì)介紹：
- 構(gòu)建人高遷移率組蛋白（HMGB1）的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入TaxP及TaxN細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，并研究其對(duì)Tax蛋白表達(dá)的T細(xì)胞中NF-κB活性的影響。進(jìn)而為臨床研究HMGB1與成人T淋巴細(xì)胞白血?。ˋTL）的發(fā)病甚至臨床檢測(cè)治療提供理論依據(jù)。
作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 目的：構(gòu)建人HMGB1真核表達(dá)載體，并研究其對(duì)Tax蛋白表達(dá)的T細(xì)胞中NF-κB活性的影響。進(jìn)而為臨床研究HMGB1與成人T淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病提供依據(jù)。 思路：1.人HMGB1真核表達(dá)載體的構(gòu)建 2.RT-PCR檢測(cè)HMGB1、p65及Tax基因mRNA 3.Western blot檢測(cè)HMGB1及p65蛋白 4.熒光素酶檢測(cè)NF-κB活性 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 本實(shí)驗(yàn)特別地從HMGB1和 HTLV-1病毒Tax蛋白表達(dá)的T細(xì)胞中NF-κB活性的關(guān)系出發(fā)，由構(gòu)建HMGB1真核表達(dá)載體入手，經(jīng)RT-PCR、Western blot、熒光素酶檢測(cè)等多種分子生物學(xué)方法論證，對(duì)HMGB1進(jìn)行了一系列的研究。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Tax蛋白可以促進(jìn)HMGB1的蛋白表達(dá)，也提示NF-κB活性和HMGB1表達(dá)呈正相關(guān)，而為進(jìn)一步研究HMGB1在ATL發(fā)病中的作用奠定理論基礎(chǔ)。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- Tax蛋白是由成人T淋巴細(xì)胞1型病毒（HTLV-1）的Tax基因編碼，在成人T淋巴細(xì)胞白血?。ˋTL）發(fā)病早期其關(guān)鍵作用，研究已表明，Tax蛋白可以最終導(dǎo)致HTLV-1病毒感染細(xì)胞最終發(fā)展為ATL細(xì)胞，這可能是ATL的發(fā)病的主要機(jī)制。為此我們準(zhǔn)備構(gòu)建HMGB1的真核表達(dá)載體，并研究其與Tax蛋白及NF-κB的活性之間的關(guān)系，以期以新的思路為ATL的發(fā)病提供理論依據(jù)。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 摘要 目的：構(gòu)建人高遷移率組蛋白1(high mobility group box-1，HMGB1)的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入TaxP及TaxN細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)并研究其對(duì)Tax蛋白表達(dá)的T細(xì)胞中NF-KB活性的影響。方法：用RT-PCR方法擴(kuò)增人T淋巴細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞中HMGB1的cDNA，連接于真核表達(dá)載體pcDNA3.0；將pcDNA3.0-HMGB1轉(zhuǎn)染TaxP及TaxN細(xì)胞，48h后檢測(cè)RT-PCR檢測(cè)HMGB1和Tax mRNA的表達(dá)，HMGB1及p65蛋白的表達(dá)；將pcDNA3.0-HMGB1和NF-κB報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染TaxP及TaxN細(xì)胞48h后檢測(cè)熒光素酶活性。 結(jié)果：成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-HMGB1；Tax可以促進(jìn)HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)；HMGB1可以促進(jìn)p65 mRNA和蛋白的表達(dá)，并與上調(diào)NF-κB活性。 結(jié)論：HMGB1能協(xié)同Tax蛋白激活NF-κB
獲獎(jiǎng)情況
- 《中國(guó)免疫學(xué)》雜志2010年第11期第26卷 發(fā)表文章 “HMGB1對(duì)HTLV-1病毒Tax蛋白表達(dá)的T細(xì)胞中NF-κB活性的影響”
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- 一、相關(guān)技術(shù)： 1.載體的構(gòu)建 （1）質(zhì)粒的制備及純化（2）DNA的限制性內(nèi)切酶酶切技術(shù) （3）DNA重組技術(shù)（4）DNA凝膠電泳，從凝膠中回收純化DNA 2.產(chǎn)物的檢測(cè) （1）RT-PCR技術(shù)（2）Western blot印跡法（3）細(xì)胞培養(yǎng) （4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù) 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 二、相關(guān)文獻(xiàn)： [1]Yang H, Wang H, Czura CJ, et a1. The cytokine activity of HMGB1[J]. J Leukoc Biol, 2005, 78(1)：l-8． [2] Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromat protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J]. Nature, 2002, 418(6894):191-195． [3]Peloponese J M Jr，Yasunaga J，Kinjo T, et a1. Peptidylproline cis-trans-isomerase Pinl interacts with human T cell leukemia virus type 1 tax and modulates its activation of NF-kappaB[J].J Virol,2009;83(7):3238-3248. [4] 夏云, 石瑛, 高琰 等。Tax基因表達(dá)細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)活性的初步研究。中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2008; 16(6):1425-1429. [5]Reinhard, E.Voll, Vilma Urbonaviciute, et al. High Mobility Group box 1 in the Pathogenes is of Inflammatory and Auto immune Diseases[J]. IMAJ, 2008, 10(25):26-28 等
同類課題研究水平概述
- HMGBl作為重要的晚期炎癥介質(zhì)，目前已經(jīng)進(jìn)行了多方位的研究。然而，HMGBl對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)影響及機(jī)制，尚待探討。在一些腫瘤，如非小細(xì)胞癌、胰腺癌、乳腺癌等發(fā)生時(shí)都有HMGBl過(guò)表達(dá)的出現(xiàn)，當(dāng)前研究表明，HMGBl與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、新生血管的形成和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡及耐藥的形成等密切相關(guān)。那HMGB1會(huì)不會(huì)與ATL發(fā)病甚至治療相關(guān)呢？ 研究表明，成人T淋巴細(xì)胞1型病毒(HTLV-1)主要侵犯人CD4+T淋巴細(xì)胞，HTLV1型病毒的tax基因編碼的Tax蛋白在病毒侵犯T細(xì)胞后可明顯促進(jìn)其活化并最終導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成人T淋巴細(xì)胞白血病(adult T-cell leukemia, ATL)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)表明TaxP細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯高于TaxN細(xì)胞，NF-κB活性也明顯高于TaxN細(xì)胞，另外NF-κB亞基p65的mRNA和蛋白表達(dá)也明顯高于TaxN細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析也提示NF-κB活性和HMGB1表達(dá)呈正相關(guān)，這提示Tax作為HTLV1型病毒編碼的重要蛋白，可以導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞活化，這與國(guó)外及本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道相一致。同時(shí)活化后的T細(xì)胞HMGB1表達(dá)高于Tax陰性的TaxN細(xì)胞，這提示Tax可以促進(jìn)HMGB1的表達(dá)，但是由于Tax蛋白主要存在于早期病毒感染的細(xì)胞，而60%病人的ATL細(xì)胞并不能檢測(cè)到Tax蛋白的存在，所以Tax蛋白促進(jìn)HMGB1的表達(dá)應(yīng)該在病毒感染早期即炎癥階段，可能通過(guò)自分泌和（或）旁分泌作用于自身或鄰近的T細(xì)胞，并于T細(xì)胞膜表面的RAGE、TLR4、TLR2結(jié)合進(jìn)而刺激NF-κB的活化，活化的NF-κB可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，而炎癥介質(zhì)的釋放必將正反饋第導(dǎo)致NF-κB的持續(xù)活化，另外高表達(dá)的HMGB1作為核內(nèi)的一種非組蛋白，可以通過(guò)與雙鏈螺旋狀DNA的小溝結(jié)合穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)，使得病毒感染細(xì)胞存活期延長(zhǎng)，最終使得病毒感染細(xì)胞發(fā)展為ATL細(xì)胞。由于HMGB1蛋白和NF-κB的正相關(guān)，且HMGB1的過(guò)表達(dá)并不會(huì)影響Tax mRNA的表達(dá)，多數(shù)認(rèn)為盡管HMGB1參與Tax對(duì)NF-κB的活化，可是HMGB1并不會(huì)正反饋促進(jìn)Tax基因的表達(dá)。盡管Tax可以促進(jìn)HMGB1表達(dá)，但是HMGB1在ATL發(fā)病中究竟扮演什么角色仍需要進(jìn)一步研究。
