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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 同時(shí)檢測(cè)CSFV和PRRSV一步法RT-PCR方法的建立及在云南部分地區(qū)的應(yīng)用
- 來(lái)源：
- 第十二屆“挑戰(zhàn)杯”省賽作品
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡(jiǎn)介：
- 豬瘟（CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是嚴(yán)重危害云南養(yǎng)豬業(yè)的疾病，二者同時(shí)感染豬群的比例很大，且在臨床癥狀和病理變化上不易區(qū)分。為了建立一種能快速診斷CSF和PRRS混合感染的方法，根據(jù)NCBI上已發(fā)表的CSFV保守基因Erns和PRRSV保守基因M基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，經(jīng)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件后，建立了CSFV和PRRSV一步法RT-PCR的檢測(cè)方法。
- 詳細(xì)介紹：
- 近幾年，在云南省部分地區(qū)中經(jīng)常發(fā)生豬高熱病大部分診斷為藍(lán)耳病病毒與豬瘟病毒混合性感染所致。豬瘟是一種烈性傳染病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。豬繁殖與呼吸綜合征是20世紀(jì)80年代后期出現(xiàn)的，以母豬繁殖障礙和各日齡豬呼吸道疾病為特征的傳染病。這兩種病在臨床癥狀和病理變化上不易區(qū)分，而且二者在云南地區(qū)同時(shí)感染豬群的比例很大。目前，常規(guī)方法大都無(wú)法同時(shí)檢測(cè)這2種病毒，所以建立一種同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分這2種病毒的方法十分必要。針對(duì)云南省豬病發(fā)生情況，以及豬瘟病毒及藍(lán)耳病病毒均屬于RNA病毒這一特點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)了一步法RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)這兩種病毒核酸的方法，大大節(jié)約時(shí)間和試劑，也避免了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中反轉(zhuǎn)錄和PCR多個(gè)環(huán)節(jié)造成污染的機(jī)會(huì)。用本研究建立的一步法RT-PCR方法對(duì)云南地區(qū)部分豬場(chǎng)送檢的“高熱病”發(fā)病豬的樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，證實(shí)本研究設(shè)計(jì)的引物的敏感性完全滿足一般實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要。本研究為云南豬瘟和藍(lán)耳病混合感染的快速檢測(cè)提供了重要的技術(shù)支持。
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作品專業(yè)信息
撰寫(xiě)目的和基本思路
- 豬高熱病近幾年在云南省部分地區(qū)中經(jīng)常發(fā)生。其中大部分診斷為藍(lán)耳病毒與豬瘟病毒混合性感染所致。為了建立一種能快速診斷這兩種病混合感染的方法，利用復(fù)合一步法PCR技術(shù)原理，根據(jù)豬瘟病毒保守基因Erns和藍(lán)耳病病毒保守基因M基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物。修改引物位置、優(yōu)化引物參數(shù)，同時(shí)對(duì)其最佳反應(yīng)條件、特異性及敏感性進(jìn)行優(yōu)化及測(cè)定，建立豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒一步法RT-PCR的檢測(cè)方法。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 動(dòng)物傳染病的確診通常需要病原學(xué)檢測(cè)，目前常用的檢測(cè)方法中，RT-PCR的特異性和敏感性較高。復(fù)合一步法PCR方法不但可以同時(shí)擴(kuò)增兩條目的基因，而且也節(jié)省了試劑，減少了污染的機(jī)會(huì)。本研究建立的一步法RT-PCR方法能在一次反應(yīng)中對(duì)所懷疑的由CSFV和PRRSV 2種病原體引起的傳染病進(jìn)行病原診斷，且特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便，具有廣闊的應(yīng)用前景。
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 藍(lán)耳病與豬瘟這兩種病在臨床癥狀和病理變化上不易區(qū)分，而且二者在云南地區(qū)同時(shí)感染豬群的比例很大。目前，常規(guī)方法大都無(wú)法同時(shí)檢測(cè)這2種病毒，所以建立一種同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分這豬繁殖與藍(lán)耳病病毒的方法十分必要。本研究設(shè)計(jì)了一步法RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)這兩種病毒核酸的方法，設(shè)計(jì)的引物的敏感性完全滿足一般實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要。本研究為云南豬瘟和藍(lán)耳病混合感染的快速檢測(cè)提供了重要的技術(shù)支持。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 豬瘟和藍(lán)耳病是嚴(yán)重危害云南養(yǎng)豬業(yè)的疾病,為了建立一種能快速診斷豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征混合感染的方法，根據(jù)NCBI上已發(fā)表的豬瘟病毒保守基因Erns和藍(lán)耳病病毒保守基因M基因的核苷酸序列，利用Oligo 6.0設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)條件優(yōu)化后，建立了豬瘟病毒和藍(lán)耳病病毒一步法RT-PCR的檢測(cè)方法。在云南部分地區(qū)中豬高熱病病料檢測(cè)的結(jié)果表明，本方法具有良好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，本研究為云南豬瘟和藍(lán)耳病混合感染的快速檢測(cè)提供了重要的技術(shù)支持。
獲獎(jiǎng)情況
- 2011年5月獲云南農(nóng)業(yè)大學(xué)第九屆“挑戰(zhàn)杯”學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽一等獎(jiǎng)； 2011年6月獲云南省第六屆高校青年學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽三等獎(jiǎng)； 2011年6月文章發(fā)表于核心期刊《動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》；
鑒定結(jié)果
- 無(wú)
參考文獻(xiàn)
- [1] 冷和平, 溫育銘, 曾俊霞, 等.豬瘟對(duì)我國(guó)當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)危害的客觀評(píng)價(jià)及其有效防治措施[J].豬業(yè)科學(xué)，2009，26(6)：74-77. [2]李讓云. 豬藍(lán)耳病與豬瘟混合感染的防控[J]．畜牧與飼料科學(xué)，2010，(2)：182-183. [3] Cheon D，Chae C. Comparison of virus isolation，reverse transcription polymerase chain reaction，immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus from naturally aborted fetuses and stillborn piglets[J]. J Vet Diagn Invest, 2000, 12: 582-587. [4] Soares R M, Durigon E L, Bersano J G, et a1．Detection of porcine parvovirus DNA by the polymerase chain reaction assay using primers to the highly conserved．Non-structural protein gene NS-l [J]. J Virol Methods, 1999, 78: 191-198. [5] Van Woensel P, Vander W J, Visser N. Detection of porcine reproductive respiratory syndrome virus by the polymerase chain reaction [J]. J Virol Methods, 1994, 47: 273-278. [6]覃芳蕓, 黃夏, 陳義祥, 等.CSFV的RT-PCR檢測(cè)在控制與凈化豬瘟中的應(yīng)用[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28(6)：17-18.
同類課題研究水平概述
- 豬瘟是一種烈性傳染病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。豬繁殖與呼吸綜合征是20世紀(jì)80年代后期出現(xiàn)的，以母豬繁殖障礙和各日齡豬呼吸道疾病為特征的傳染病。這兩種病在臨床癥狀和病理變化上不易區(qū)分，而且二者在云南地區(qū)同時(shí)感染豬群的比例很大。目前用于動(dòng)物傳染病的方法有很多種，如分離鑒定、抗體檢測(cè)的免疫過(guò)氧化物單層試驗(yàn)(IPMA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、血清中和試驗(yàn)(SVN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。病原的分離鑒定耗時(shí)耗力，且有許多干擾因素，這些方法一般都比較繁瑣，而且準(zhǔn)確度不高，不利于疾病的快速診斷。而RT-PCR具有高敏感度、高特異性、快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于RNA病毒病的診斷，在CSF和PRRS的診斷上也取得了很大進(jìn)展。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)已滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，多重PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)，在臨床診斷上潛力十分巨大。近年來(lái)多重PCR技術(shù)有關(guān)文獻(xiàn)已有幾百篇，多重PCR方法已被成功地應(yīng)用到了生物學(xué)的多個(gè)方面，如各類病原的檢測(cè)與鑒別、遺傳疾病診斷、以及基因缺失、突變和多態(tài)性分析等。該技術(shù)已經(jīng)比較成熟，但應(yīng)用多重一步法RT-PCR技術(shù)對(duì)動(dòng)物疾病病原進(jìn)行鑒別診斷的報(bào)道卻不多，且任然存在一定的技術(shù)問(wèn)題，如在雙重PCR反應(yīng)體系中，同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)基因，設(shè)計(jì)引物時(shí)如何避開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)；退火溫度不能過(guò)高或過(guò)低，且要使兩對(duì)引物退火溫度相等或接近；保證GC含量相等或接近，以避免引物與引物之間的雜交等。目前該技術(shù)僅處于實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)研究階段，尚未進(jìn)入臨床應(yīng)用。
