基本信息
- 項目名稱：
- 白屈菜紅堿逆轉(zhuǎn)人乳腺癌多藥耐藥機制探究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術(shù)論文
- 簡介：
- 本研究應用western blot、RT-PCR和MTT等方法，探討了白屈菜紅堿逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥性的可能分子機制。證實白屈菜紅堿可下調(diào)乳腺癌耐藥細胞系MCF-7Taxol中P糖蛋白的表達，而有效抑制其多藥耐藥性。并提出在人乳腺癌細胞中，MDR1、MRP1、ABCG2基因的上調(diào)是PKCα誘發(fā)的多藥耐藥性的下游信號。為白屈菜紅堿（CH）作為一種治療乳腺癌多藥耐藥的新型藥物提供理論基礎(chǔ)。
- 詳細介紹：
- 【背景】 乳腺癌細胞在藥物誘導下對結(jié)構(gòu)和功能不相關(guān)的藥物產(chǎn)生耐藥，稱多藥耐藥現(xiàn)象。在乳腺癌細胞中多藥耐藥與幾種轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)：P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(ATP-binding cassette,C-subfamily (CFTR/MRP),member 1,ABCC1)和乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(ATP-binding cassette,?G-subfamily,member 2,ABCG2) [1-4]，這些蛋白作為藥物排出泵，可以降低胞內(nèi)的細胞毒性藥物濃度。蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的同工酶，特別是PKCα，對腫瘤細胞表型的出現(xiàn)或維持可能起著重要作用[5-6]，而白屈菜紅堿(chelerythrine, CH)是PKCα高效選擇性抑制劑[7]。本研究旨在探討CH協(xié)同臨床常用化療藥紫杉醇和阿霉素逆轉(zhuǎn)人乳腺癌多藥耐藥的機制，為臨床改善乳腺癌化療效果提供新思路。 【實驗方法及結(jié)果】 RT-PCR檢測CH對耐藥細胞系MCF-7Taxol中耐藥基因ABCG2、ABCC1和MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄影響 用0.1 μmol/L PMA、0.1 μmol/L CH分別處理MCF-7Taxol12 h、72 h后，提取總RNA進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)：在β-actin擴增條帶基本相同的情況下，CH可以下調(diào)MCF-7Taxol細胞中MDR1的轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05），而對另外兩個多藥耐藥基因ABCG2、ABCC1影響不明顯(P均>0.05)；反之，PMA可以增加MCF-7Taxol細胞中MDR1的轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05），同樣對ABCG2、ABCC1的mRNA水平作用也不明顯(P均>0.05) Western blot檢測P-gp含量和PKCα蛋白及磷酸化水平 0.1 μmol/L PMA、0.1μmol/L CH分別作用于MCF-7Taxol 12 h、72 h后，Western blot研究表明：PMA處理MCF-7Taxol細胞后，PKCα磷酸化水平提高（P<0.05），P-gp表達量明顯增加（P<0.05）；而CH則可有效抑制PKCα的磷酸化（P<0.05），并降低P-gp含量（P<0.05），并且此效應隨時間延長而更為顯著。 MTT法測定乳腺癌細胞對PMA、CH的藥物敏感性 選對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細胞和MCF-7Taxol細胞，分別接種于96孔板上，每孔細胞數(shù)為2×104，培養(yǎng)過夜后加藥。PMA和CH均以4 μmol /L為起始濃度對倍稀釋(4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μmol/L)，每組做3個平行孔，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。MTT實驗表明：0.0625~4 μmol/L的CH和PMA作用于MCF-7和MCF-7Taxol細胞72 h后，均可產(chǎn)生細胞毒性作用；其作用存在劑量效應，且隨劑量的增加，對細胞生長的抑制更明顯。CH對MCF-7敏感株的IC50為（0.16±0.02）μmol/L，對MCF-7Taxol耐藥株的IC50為（0.21±0.04）μmol/L；PMA對MCF-7敏感株的IC50為（0.23±0.07）μmol/L，對MCF-7Taxol耐藥株的IC50為（0.26±0.06）μmol/L。 PMA、CH對乳腺癌細胞多藥耐藥性的影響測定 分別用0.1 μmol/L PMA、0.1 μmol/L CH（均低于IC20值劑量）預處理MCF-7和MCF-7Taxol細胞60 h后，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，37℃繼續(xù)加藥孵育12 h，PBS輕洗3次后分為兩組，一組更換含阿霉素的培養(yǎng)液；另一組更換紫杉醇的培養(yǎng)液。阿霉素終濃度梯度依次為2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL，紫杉醇終濃度梯度依次為0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL，每個濃度設(shè)3個復孔。對照只加培養(yǎng)液和溶劑。37℃孵育24 h后進行MTT實驗，發(fā)現(xiàn)：0.1 μmol/L的PKCα特異性抑制劑CH處理MCF-7Taxol細胞72 h后，其對紫杉醇和阿霉素的耐藥性分別降低為處理前的0.17和0.27倍（P<0.01）；MCF-7Taxol細胞接受0.1 μmol/L的PMA處理72 h后，其對Tax、ADM耐藥性為處理前的3.37和2.92倍（P<0.01）。而接受PMA和CH預處理后，MCF-7耐藥性變化卻不顯著（P>0.05）。表明PKCα功能的上調(diào)可以提高乳腺癌耐藥細胞株的多藥耐藥性，CH則可抑制上述過程。 【討論】 本研究通過使用PKCα激動劑和抑制劑改變MCF-7Taxol細胞中PKCα功能，來探究PKCα與乳腺癌細胞多藥耐藥的關(guān)系。結(jié)果表明，使用PMA72 h后MCF-7Taxol細胞的MDR1表達水平明顯升高，而ABCC1和ABCG2的表達則未顯出與PKCα功能有明顯相關(guān)性。Western blot結(jié)果表明多藥耐藥細胞株MCF-7Taxol中pPKCα含量增加時，P-gp的表達增加。MTT結(jié)果表明，使用PKCα激動劑PMA后，MCF-7Taxol細胞對紫杉醇和阿霉素的耐藥性分別增加3.37和2.92倍。筆者認為，其耐藥性的變化，可能是MCF-7Taxol細胞中PKCα功能的上調(diào)增加了MDR1的轉(zhuǎn)錄水平，增強了P-gp對化療藥物的轉(zhuǎn)運功能， 從而導致耐藥性增加。而使用PKCα抑制劑CH后，MCF-7Taxol細胞對紫杉醇和阿霉素的耐藥性分別為加藥前的0.17和0.27倍，其機制可能為通過抑制PKCα活性，降低PKCα對MDR1的調(diào)控，下調(diào)P-gp的表達，從而減低其藥物泵功能，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的多藥耐藥。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)PMA和CH對乳腺癌敏感細胞株MCF-7耐藥性影響卻不明顯，表明PKCα活性改變與乳腺癌敏感細胞可能無關(guān)。 【參考文獻】 [1] Schneiderman RS, Shmueli E, Kirson ED, et al. TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters[J]. BMC Cancer,2010,10(5):229. [2] Takabe K, Kim RH, Allegood JC, et al. Estradiol induces export of sphingosine 1-phosphate from breast cancer cells via ABCC1 and ABCG2[J]. J Biol Chem,2010,285(14):10477-10486. [3] Oh WK, Cho KB, Hien TT, et al. Amurensin G, a potent natural SIRT1 inhibitor, rescues doxorubicin responsiveness via down-regulation of multidrug resistance 1[J]. Mol Pharmacol,2010,78(5):855-864. [4] 程燕紅,齊靜,熊冬生,等.鈣調(diào)素拮抗劑O-(4-乙氧基)-丁基-小檗胺對乳腺癌多藥耐藥細胞系MCF-7/ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)作用[J].中國醫(yī)學科學院學報,2006,28(2):164-168. [5] Gleave ME, Monia BP. Antisense therapy for cancer[J]. Nat Rev Cancer,2005,5(6):468-472. [6] E?dus LKh, Emel'ianov MO, Korystova AF, et al. Multidrug resistance increase of tumor cells at the effect of radiation and phorbol ether depends on protein kinase C and reactive oxygen species[J]. Radiats Biol Radioecol,2010,50(1):37-41.
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 乳腺癌的多藥耐藥與P-糖蛋白介導的藥物外排聯(lián)系密切，研究表明，PKCα可上調(diào)P-糖蛋白表達。采用PKCα抑制劑CH及激動劑PMA，結(jié)合乳腺癌常用化療藥紫杉醇和阿霉素。分析隨著PKCα活性改變，耐藥細胞系MCF-7Taxol的存活率及耐藥相關(guān)基因ABCG2，ABCC1，MDR1和P糖蛋白表達變化，從而闡明CH改善乳腺癌多藥耐藥的理論基礎(chǔ)及其作為新型藥物的潛在療效。
科學性、先進性及獨特之處
- 1、本實驗首次發(fā)現(xiàn)白屈菜紅堿能作為紫杉醇及阿霉素的化療輔助藥物，有效降低乳腺癌細胞的多藥耐藥性。 2、首次闡明了白屈菜紅堿逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥性的分子機制，提出MDR1基因的上調(diào)是PKCα誘發(fā)的多藥耐藥性的下游信號。
應用價值和現(xiàn)實意義
- 1、證實PKCα在誘發(fā)乳腺癌多藥耐藥的重要調(diào)控作用。 2、提出PKCα也是治療乳腺癌多藥耐藥的新藥物靶點。 3、為PKCα抑制劑和siRNA在乳腺癌化療中的使用提供理論基礎(chǔ)。
學術(shù)論文摘要
- 目的：研究PKCα抑制劑白屈菜紅堿(CH)逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細胞多藥耐藥的機制。方法：應用RT-PCR和Western blot方法，檢測CH和PMA作用于乳腺癌耐藥細胞系MCF-7Taxol后，耐藥相關(guān)基因ABCG2、ABCC1、MDR1和P糖蛋白表達的變化。采用MTT方法，分析給予低劑量CH和PMA后，MCF-7Taxol細胞對紫杉醇以及阿霉素耐藥性的變化。結(jié)果：RT-PCR和Western blot結(jié)果表明：CH可以下調(diào)MDR1轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05），降低P糖蛋白的表達（P<0.05）；PMA在提高MDR1轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05）同時增加P糖蛋白的含量（P<0.05）。MTT分析發(fā)現(xiàn)：0.1 μmol/L的CH預處理的MCF-7Taxol對紫杉醇和阿霉素耐藥性分別降低為加藥前的0.17和0.27倍（P<0.01）；而使用0.1 μmol/L的PMA預處理后，MCF-7Taxol對紫杉醇和阿霉素耐藥性分別增加了3.37和2.92倍（P<0.01）。結(jié)論：白屈菜紅堿可以逆轉(zhuǎn)人乳腺癌細胞的多藥耐藥性，其機制與抑制PKCα活性，下調(diào)MDR1基因轉(zhuǎn)錄水平，降低其表達產(chǎn)物P-gp的水平有關(guān)。
獲獎情況
- 1本實驗獲江蘇省高等學校大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃 （20090372）立項資助 2本研究成果成果于2011年2月在《中國醫(yī)學科學院學報》（medline收錄，中文核心期刊）33卷第一期 45-50頁發(fā)表 3本研究設(shè)計榮獲首屆全國大學生基礎(chǔ)醫(yī)學創(chuàng)新論壇暨實驗設(shè)計大賽“優(yōu)秀獎”
鑒定結(jié)果
- 申報者的申報情況屬實。該作品是第一臨床醫(yī)學院、第四臨床醫(yī)學院及康達學院的四名同學共同完成的，研究論文數(shù)據(jù)可靠，結(jié)論合理，推薦其參加“挑戰(zhàn)杯”科技作品競賽申報。
參考文獻
- 應用技術(shù)： 1RT-PCR 2Western blot 3MTT 4細胞培養(yǎng)技術(shù) 參考文獻： 印莉萍, 祁小廷.細胞分子生物學技術(shù)教程.第2版.北京:科學出版社,2005
同類課題研究水平概述
- 乳腺癌在女性惡性腫瘤中居首位，多藥耐藥成為影響乳腺癌患者療效的首要難題。多藥耐藥，即腫瘤細胞一旦對一種抗癌藥物產(chǎn)生耐藥，就可對非同一類型的多種結(jié)構(gòu)、細胞靶點和作用機理迥然不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。細胞的多藥耐藥由多種機制調(diào)控，目前主要認為，由MDR1編碼的P-gp作為三磷酸腺苷依賴性跨膜轉(zhuǎn)運因子，具有藥物轉(zhuǎn)運泵功能，將藥物泵出細胞，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生多藥耐藥。 PKCα是PKC家族的一種亞型。近年的研究認為，P-gp轉(zhuǎn)運藥物受PKCα信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)，如PKC激動劑PMA通過對P-gp磷酸化非依賴方式，可降低細胞內(nèi)的藥物聚集，增強腫瘤的耐藥性。然而，Yu等用編碼PKCα的cDNA 轉(zhuǎn)染藥物敏感細胞，發(fā)現(xiàn)MDR1過表達，其耐藥性顯著增加。該研究表明，PKCα可能參與對MDR1轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化而調(diào)控MDR1的轉(zhuǎn)錄水平。 本研究通過使用PKCα激動劑和抑制劑改變MCF-7Taxol細胞中PKCα功能，來探究PKCα與乳腺癌細胞多藥耐藥的關(guān)系。結(jié)果表明，使用PMA72 h后MCF-7Taxol細胞的MDR1表達水平明顯升高，而ABCC1和ABCG2的表達則未顯出與PKCα功能有明顯相關(guān)性，此結(jié)果與文獻報道一致。Western blot結(jié)果表明多藥耐藥細胞株MCF-7Taxol中pPKCα含量增加時，P-gp的表達增加。MTT結(jié)果表明，使用PKCα激動劑PMA后，MCF-7Taxol細胞對紫杉醇和阿霉素的耐藥性分別增加3.37和2.92倍。筆者認為，其耐藥性的變化，可能是MCF-7Taxol細胞中PKCα功能的上調(diào)增加了MDR1的轉(zhuǎn)錄水平，增強了P-gp對化療藥物的轉(zhuǎn)運功能，從而導致耐藥性增加。而使用PKCα抑制劑CH后，MCF-7Taxol細胞對紫杉醇和阿霉素的耐藥性分別為加藥前的0.17和0.27倍，其機制可能為通過抑制PKCα活性，降低PKCα對MDR1的調(diào)控，下調(diào)P-gp的表達，從而減低其藥物泵功能，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞的多藥耐藥。本實驗首次發(fā)現(xiàn)將白屈菜紅堿作為紫杉醇及阿霉素的化療輔助藥物可以有效降低乳腺癌細胞的多藥耐藥性。為PKCα抑制劑和siRNA在乳腺癌化療中的使用提供了一定的理論基礎(chǔ)。
