基本信息
- 項目名稱：
- 雞β-防御素AvBD-5真核載體構建及免疫活性的研究
- 小類：
- 生命科學
- 大類：
- 自然科學類學術論文
- 簡介：
- 本文設計構建帶有雞β-防御素AvBD-5基因的SEp9 DNA疫苗，將重組質粒導入小鼠體內，使小鼠獲得對腸炎沙門氏菌的抗性，為研究SEp9 DNA疫苗和AvBD-5作為內源免疫物質的免疫作用免疫活性在家禽養(yǎng)殖業(yè)中的應用，將其作為一種高效無毒、無殘留的免疫促進劑替代抗生素，提高家禽抗病力以及禽產品的安全性，對禽類的生產以及禽產品的安全具有重要的意義。
- 詳細介紹：
- 前言 本文設計構建帶有雞β-防御素AvBD-5基因的SEp9 DNA疫苗，將重組質粒導入小鼠體內，使小鼠獲得對腸炎沙門氏菌的抗性，為研究SEp9 DNA疫苗和AvBD-5作為內源免疫物質的免疫作用免疫活性在家禽養(yǎng)殖業(yè)中的應用，將其作為一種高效無毒、無殘留的免疫促進劑替代抗生素，提高家禽抗病力以及禽產品的安全性，對禽類的生產以及禽產品的安全具有重要的意義。 材料與方法 采用PCR的方法擴增AvBD-5及SEp9基因，分別構建重組真核表達載體pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9及pVAX1-SEp9-AvBD5；用去內毒素質粒抽提法獲得高純度無內毒素重組真核表達質粒，作為DNA疫苗免疫動物后，用ELISA檢測小鼠血清中特異性IgG抗體水平，實時熒光定量PCR法檢測腸組織中MCP-1基因表達量差異，分離小鼠淋巴細胞，用流式細胞術分析T淋巴細胞亞群含量變化，在首免后第42天用腸炎沙門氏菌對小鼠攻毒，檢測免疫保護效率。 設計AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗，單獨或聯(lián)合的體液免疫、粘膜免疫方式導入到動物體內，使其獲得對腸炎沙門氏菌的抗性，初步測定AvBD-5 DNA疫苗和SEp9 DNA疫苗的免疫效應并研究DNA疫苗的保護效應和雞β-防御素AvBD-5的免疫活性， 結果 研究結果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠體內刺激免疫應答，產生抗SEp9的特異性抗體，pVAX1-SEp9-AvBD5組的IgG抗體OD450nm與對照組相比最高，達到0.33，同時能誘導腸組織產生MCP-1，引起T淋巴細胞亞群增殖，與對照相比，最高分別為63.17%、43.11%、20.57%。攻毒后pVAX1-SEp9組和pVAX1-SEp9-AvBD5組中小鼠新鮮糞便中SE菌落數與對照組相比明顯下降，pVAX1-SEp9-AvBD5組在攻毒后的第4天，糞便中僅含SE 22.90CFU/g。 結論 實驗首次將AvBD5同時作為抗菌多肽和內源免疫物質研究其對腸炎沙門氏菌的免疫增強作用，探尋AvBD5作為一種新型免疫佐劑使用的可能性。研究結果證明了雞β-防御素AvBD-5能有效刺激雞的免疫防御系統(tǒng)，增加機體特異性免疫應答的能力，提高了小鼠對腸炎沙門氏菌感染的保護效率，為AvBD-5作為一種新型免疫佐劑，應用于DNA疫苗的研究與開發(fā)奠定了基礎。
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作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 禽類是眾多病原體的攜帶者，病原體造成禽類產品污染，同時也威脅人類健康。在抗生素替代劑中，抗菌肽具有廣譜抗菌活性、抗病毒和免疫增強等作用，對機體無毒害、無殘留等，備受關注。 本實驗在已有研究的基礎上，設計AvBD-5 DNA和SEp9 DNA疫苗，單獨或聯(lián)合的體液、粘膜免疫方式導入到動物體內，測定AvBD-5 DNA和SEp9 DNA疫苗的免疫效應。以此研究預防禽腸炎沙門氏菌感染的DNA疫苗。
科學性、先進性及獨特之處
- 1.首次從粵黃雞舌頭組織中克隆雞β-防御素AvBD5成熟肽基因 2.將IRES插入真核表達載體pVAX1的多克隆位點中，構建雙順反子真核表達載體pVAX1-IRES，并將SEp9基因和AvBD5成熟肽基因插入雙順反子載體中，構建了共表達載體該載體可同時獨立的表達SEp9基因和AvBD5成熟肽基因 3.首次將AvBD5同時作為抗菌多肽和內源免疫物質，探尋AvBD5作為新型免疫佐劑使用的可能性
應用價值和現實意義
- 本研究旨在發(fā)展完善一種新型高效的預防家禽腸炎沙門氏菌感染的DNA藥物，研究禽β-防御素AvBD-5的免疫活性，并探討能使其作為一種新型免疫佐劑的可能性。本研究設計構建帶有雞β-防御素AvBD-5基因的DNA疫苗，將重組質粒導入模式動物小鼠體內，使其獲得對腸炎沙門氏菌的抗性，并研究DNA疫苗的保護效應和雞β-防御素AvBD-5的免疫活性。為AvBD-5作為佐劑，應用于DNA疫苗的研究開發(fā)奠定基礎。
學術論文摘要
- AvBD是禽類先天內源免疫防御系統(tǒng)重要組成部分。本文構建了3個重組真核表達載體： pVAX1-AvBD5、pVAX1-SEp9和共表達載體pVAX1-SEp9-AvBD5。將3個重組質粒作為DNA疫苗免疫小鼠。檢測小鼠血清中特異性IgG抗體水平，實時熒光定量PCR法檢測腸組織中MCP-1基因表達量差異；分離小鼠淋巴細胞，用流式細胞術分析T淋巴細胞亞群含量變化。檢測免疫保護效率，結果表明pVAX1-SEp9、pVAX1-SEp9-AvBD5均能在小鼠體內刺激免疫應答，產生抗SEp9的特異性抗體小鼠新鮮糞便中SE菌落數與對照組相比明顯下降。本研究證明了雞AvBD-5能有效刺激雞免疫防御系統(tǒng)，增加機體特異性免疫應答能力，提高小鼠對SE感染的保護效率。 研究結果證明了雞β-防御素AvBD-5能有效刺激雞的免疫防御系統(tǒng)，增加機體特異性免疫應答的能力，提高了小鼠對腸炎沙門氏菌感染的保護效率，為AvBD-5作為一種新型免疫佐劑，應用于DNA疫苗的研究與開發(fā)奠定了基礎。
獲獎情況
- 2010年華南農業(yè)大學“丁穎杯”課外學術科技作品競賽二等獎
鑒定結果
- 經廣東省團委鑒定屬實
參考文獻
- 1、pVAX1-SEp9-AvBD5試驗組流式細胞術結果示意圖 2、Meade K G, Higgs R, Lloyd A T, et al. Differential antimicrobial peptide gene expression patterns during early chicken embryological development. Developmental and Comparative Immunology, 2009, (33): 516-524 3、Van Dijk A, Veldhuizen E J, Kalkhove S I, et al. The β-defensin gallinacin-6 is expressed in the chicken digestive tract and has antimicrobial activity against food-borne pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2007, 51(3): 912-922 4、Van Dijk A, Veldhuizen E J, Haagsman H P. Avian defensins. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2008, 124 (1-2): 1-18 5、韓宗璽, 馬得瑩, 劉勝旺等. 重組雞抗菌肽Gallinacin-9的原核表達及其抗菌活性的鑒定. 畜牧獸醫(yī)學報. 2008, 39(10): 1426-1431 6、廖文艷, 馬得瑩, 韓宗璽等. 重組雞β-防御素10蛋白的原核表達及其抗菌活性的測定. 中國預防醫(yī)學報. 2008, 10(30): 765-769
同類課題研究水平概述
- 腸炎沙門氏菌不僅能引起家禽發(fā)病死亡造成嚴重的經濟損失，而且感染家禽的產品作為腸炎沙門氏菌的攜帶者，還嚴重危害人類健康。日、美等發(fā)達國家發(fā)生的食物中毒事件中40%-80%是由禽沙門氏菌引起的，其中主要病原為腸炎沙門氏菌，每年在美國由于食物傳播沙門氏菌感染致死的超過600人，140萬人染病，每年都要花費4.64億到23億美金用于治療食物傳播沙門氏菌感染。由腸炎沙門氏菌引起人的急性胃腸炎，在世界各國有增加的趨勢，已成為國際公共衛(wèi)生的一個重要課題。 飼用抗生素被廣泛地用于降低禽類發(fā)病率和維持健康。然而，長期使用抗生素會導致抗生素在禽產品中殘留及細菌耐藥性的產生，并通過食物鏈威脅人類健康。因此，需要一種既有效又環(huán)保的新方法來控制禽類疾病。在眾多的抗生素替代劑中，抗菌肽由于其分布廣泛、具有廣譜抗菌活性、抗病毒和免疫增強等作用，并且對機體無毒害、無殘留等，越來越受到關注。 防御素是一類重要的內源性抗菌肽，具有較強的廣譜抗菌活性，在機體免疫中發(fā)揮著重要的作用。雞的染色體共編碼14種β防御素，被稱為AvBD1-14。雞β防御素作為雞的重要天然免疫屏障，廣泛分布于雞體內各種組織器官中，在雞的先天性免疫和獲得性免疫中都具有重要的作用。 利用商品化SE菌苗作為疫苗是用來控制SE污染的一種方法。然而，SE菌苗存在的內毒素可能會對雞產生潛在的危害。因此， SE亞單位疫苗的研制已經被提出。已經報道了SE鞭毛抗原可以作為疫苗的巨大潛力。SE鞭毛抗原最主要的成分是FliC抗原，而FliC抗原最主要的抗原位點是SEp9。Yukiko Toyota-Hanatani等人（2009）用SEp9和弗氏完全佐劑聯(lián)合接種雞，然后口服攻毒SE，與對照相比，SEp9的SE菌數量顯著降低，證明了SEp9抗原是一個有效的抗原，能有效的抑制SE在雞腸道的定殖。Yukiko Toyota-Hanatani等人（2008）從組織學上證明了SEp9可以成為SE亞單位疫苗的候選抗原。注射SEp9后，雞體內能產生特異性抗體，且在注射部位周圍能引起血管淋巴細胞的積聚。他們的研究顯示：SEp9作為一個亞單位疫苗，在雞SE感染后的連續(xù)免疫反應和抗原遞呈中都具有重要的作用。
