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基本信息
- 項目名稱：
- Construction of pcDNA3-CIRP and pECFP-C1-CIRP and
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 構(gòu)建冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（cold inducible RNA binding protein ,CIRP）的兩個重組質(zhì)粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP，將其轉(zhuǎn)入NIH3T3 細(xì)胞并成功實現(xiàn)真核表達(dá)。篩選獲得pECFP-C1-CIRP穩(wěn)定表達(dá)的NIH3T3 細(xì)胞株，熒光顯微鏡觀察綠色熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外，冷誘導(dǎo)凋亡實驗提示CIRP在保護(hù)細(xì)胞免受冷凋亡中具有重要作用。
- 詳細(xì)介紹：
- 冷應(yīng)激是生物機(jī)體適應(yīng)低溫的生理性反應(yīng)。如果寒冷刺激對細(xì)胞的損傷作用超過了修復(fù)能力，則誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死。動物都是通過啟動與抗冷性有關(guān)的基因和表達(dá),給出逆境保護(hù)措施,從而協(xié)助動物度過難關(guān)或逆境的?，F(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn),抗冷能力與動物基因組中抗凍蛋白基因的拷貝個數(shù)成正比。構(gòu)建冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（cold inducible RNA binding protein ,CIRP）是冷應(yīng)急反應(yīng)中一個重要的保護(hù)性蛋白。本研究從冷處理后的BALB/C小鼠睪丸組織中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增CIRP的cDNA，構(gòu)建重組入真核表達(dá)載體pcDNA3 和pECFP-C1，通過酶切鑒定篩選出陽性重組菌；利用脂質(zhì)體法將2種重組質(zhì)粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP以及空白對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NIH3T3 細(xì)胞, 36h 后熒光倒置顯微鏡及RT-PCR方法觀察及鑒定CIRP在細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確并獲得了表達(dá)；同時對pECFP-C1-CIRP 轉(zhuǎn)染組進(jìn)行G418加壓篩選，熒光顯微鏡觀察所有細(xì)胞均呈現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光，表明成功篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，而綠色熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外，說明隨著加壓篩選CIRP 融合蛋白被分泌出細(xì)胞外；最后將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于4℃、14℃、24℃ 條件下進(jìn)行冷誘導(dǎo)凋亡實驗，經(jīng)Hoechst33258熒光染色法后，細(xì)胞凋亡熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CIRP基因的細(xì)胞組凋亡程度小于對照組，在保護(hù)細(xì)胞免受冷凋亡過程中具有重要作用。
作品圖片
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 本研究為探究冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白CIRP是否具有對抗冷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的生物保護(hù)功能。首先構(gòu)建CIRP的兩個真核表達(dá)載體，在真核細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)CIRP的成功過表達(dá)。然后對比能夠穩(wěn)定表達(dá)CIRP的細(xì)胞株與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞株株以及野生株在冷刺激條件下的凋亡率，驗證CIRP是否具有保護(hù)細(xì)胞免受冷誘導(dǎo)的凋亡損傷的作用。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨特之處
- 冷誘導(dǎo)RNA 結(jié)合蛋白CIRP被鑒定出來之后多應(yīng)用于腫瘤、紫外線應(yīng)激、缺氧缺血應(yīng)激以及冬眠和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)等多方面的研究，并得到大量的證據(jù)證明CIRP是多功能的保護(hù)性蛋白。但是國內(nèi)外還未曾有資料報道這個在冷的條件下被大量誘導(dǎo)的蛋白對冷刺激自身所導(dǎo)致的凋亡是否具有抵抗作用。本研究首次提出并初步證明CIRP具有對抗冷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。
應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義
- 本論文開展有關(guān)冷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及用基因工程手段進(jìn)行調(diào)控的研究對移植器官醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的參考和應(yīng)用價值，不僅有利于深入探討冷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，而且有利于尋求新的阻斷冷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 本研究從冷處理后的BALB/C小鼠睪丸組織中提取總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增CIRP的cDNA，構(gòu)建重組入真核表達(dá)載體pcDNA3 和pECFP-C1，通過酶切鑒定篩選出陽性重組菌；利用脂質(zhì)體法將2種重組質(zhì)粒pcDNA3-CIRP 和pECFP-C1-CIRP以及空白對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NIH3T3 細(xì)胞, 36h 后熒光倒置顯微鏡及RT-PCR方法觀察及鑒定CIRP在細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確并獲得了表達(dá)；同時對pECFP-C1-CIRP 轉(zhuǎn)染組進(jìn)行G418加壓篩選，熒光顯微鏡觀察所有細(xì)胞均呈現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光，表明成功篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，而綠色熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外，說明隨著加壓篩選CIRP 融合蛋白被分泌出細(xì)胞外；最后將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于4℃、14℃、24℃ 條件下進(jìn)行冷誘導(dǎo)凋亡實驗，經(jīng)Hoechst33258熒光染色法后，細(xì)胞凋亡熒光顯微鏡檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)染CIRP基因的細(xì)胞組凋亡程度小于對照組，在保護(hù)細(xì)胞免受冷凋亡過程中具有重要作用。
獲獎情況
- 該研究的前期工作曾在中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物生理生化學(xué)分會第9次和第10次（廣州、昆明）學(xué)術(shù)會議上進(jìn)行專題報告，同時在中國生理學(xué)會東北三省生理學(xué)會（大連）進(jìn)行報告。特別是該研究收到第36屆國際生理學(xué)大會邀請，于2009年7-8月在日本京都召開的第36屆國際生理學(xué)大會進(jìn)行墻報展示和交流，得到世界生理學(xué)界學(xué)術(shù)同仁的認(rèn)可與好評。該研究的前期工作基礎(chǔ)曾在《Journal Agricultural Science and Technology USA》，《生理科學(xué)進(jìn)展》等國內(nèi)外期刊發(fā)表學(xué)術(shù)論文近10篇。其中“BALB/C鼠睪丸組織中冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆與序列分析”，獲2009年大慶市第23屆自然科學(xué)技術(shù)成果（論文類）三等獎，“Cloning and Sequence Analysis of Cold Inducible RNA-binding Protein cDNA from Testis Tissue in BALB/C Mice”獲2010年第11屆黑龍江省自然科學(xué)技術(shù)成果（論文類）三等獎。 目前，該論文正在接受《Journal of Biomedical Science and Engineering》雜志的專家評審，即將在線全文發(fā)表。
鑒定結(jié)果
- 此項未填
參考文獻(xiàn)
- [1] Peng Y, Yang PH, Tanner JA, Huang JD, Li M, Lee HF, Xu RH, Kung HF, Lin MC. (2006) Cold-inducible RNA binding protein is required for the expression of adhesion molecules and embryonic cell movement in Xenopus laevis. Biochem Biophys Res Commun 344:416-424. [2] Sakurai T, Itoh K, Higashitsuji H, Nonoguchi K, Liu Y, Watanabe H, Nakano T, Fukumoto M, Chiba T, Fujita J. (2006) Cirp protects against tumor necrosis factor-α-induced apoptosis via activation of extracellular signal-regulated kinase. Biochim Biophys Acta 1763:290–295. [3] Sambrook J, Russell W. Molecular Cloning:A Laboratory manual. 3rd ed. Beijing:Science Press, (in chinese) (2002). [4] Wellmann S, Buhrer C, Moderegger E, Zelmer A, Kirschner R, Koehne P, Fujita J, Seeger K. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1 -independent mechanism. J. Cell Sci., 117:1785–1794 (2004).
同類課題研究水平概述
- 1997年Nishiyama H等[1]首次從小鼠睪丸細(xì)胞中分離了冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（Cold inducible RNA-binding protein, CIRP）的cDNA，具有介導(dǎo)冷誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制作用。CIRP 在結(jié)構(gòu)上，它具有重要的RNA結(jié)合基序之一—RNP基序，可能參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)如mRNA剪接、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和多腺苷酸化[2]。在植物體中，許多屬于同一RNP家族的蛋白質(zhì)主要在分生組織和生長組織中表達(dá)，被推測與植物生長調(diào)節(jié)和外界刺激反應(yīng)相關(guān)。在大腸桿菌內(nèi)，冷休克蛋白A是主要的冷休克蛋白之一，與低溫環(huán)境下的細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)合成有關(guān)[3]。類似的是，低溫影響CIRP在動物細(xì)胞中的表達(dá)，介導(dǎo)以DNA合成前期延長為主要特征的哺乳動物細(xì)胞生長抑制，參與調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白合成來到達(dá)自身保護(hù)的作用，這是細(xì)胞對低溫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，對生物體生存具有重要意義[4]。 同時，CIRP也在其他多種哺乳動物小鼠、人類、大鼠、墨西哥美西螈、牛蛙、非洲爪蛙和鮭魚等細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，但蛋白的細(xì)胞定位具有特異性，種屬不同蛋白的定位也有差異；CIRP在其他應(yīng)激壓力下也能被誘導(dǎo)表達(dá)，如紫外線照射、高滲透壓和缺氧條件等[4,5,6]；CIRP參與許多生物學(xué)過程，發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，而不僅僅只參與人和動物冷應(yīng)激過程，可以說它是一種重要的生物機(jī)體多功能蛋白。它可能會為揭示人和動物冷應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供一條線索[1,7]，可能會為闡明雄性不育癥的分子機(jī)制提供啟示[8]，可能調(diào)節(jié)兩棲動物冬眠活動[9]，可能參與正常子宮內(nèi)膜周期調(diào)節(jié)及其癌癥發(fā)生[10]；它參與人和動物神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)[11]以及非洲爪蟾和墨西哥美西螈胚胎發(fā)育過程[12,13]。 細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又名細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，是用來定義PCD 過程中一些共同的形態(tài)學(xué)特征, 通過細(xì)胞內(nèi)固有的生理生化反應(yīng)或某種酶的活化而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。 Sakurai T等[14] 通過體外細(xì)胞實驗，分析在適度低溫條件下培養(yǎng)細(xì)胞和CIRP表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)CIRP 能夠憑借激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑，防止腫瘤壞死因子α 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。寒冷刺激同樣能夠?qū)е录?xì)胞膜脂過氧化，細(xì)胞水腫，細(xì)胞膜彈性、通透性以及細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器形態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。
