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全自動生化需氧量（BOD）生物傳感分析儀是利用微生物膜降解水中有機物時的呼吸作用而引起水中溶解氧的變化，通過探針測量溶解氧的濃度變化，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號輸出，從而得出測量數(shù)據(jù)的快速測定水中有機物濃度的生物傳感器。該儀器主要由生物識別元件——固定化微生物膜和物理換能器——溶解氧探針組成。它不僅克服了傳統(tǒng)測量方法測量時間長、重現(xiàn)性差等不足，且具有操作簡便、可進行現(xiàn)場測量等特點。應(yīng)用前景十分廣闊。

全自動生化需氧量（BOD）生物傳感分析儀 一、儀器的發(fā)明目的及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 生物化學(xué)需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）是表示水中有機物等需氧污染物質(zhì)含量的一個綜合指標(biāo)，它說明水中有機物由于微生物的生化作用進行氧化分解，使之無機化或氣體化時所消耗水中溶解氧的總數(shù)量，其單位以mg/L表示，其值越高，說明水中有機污染物質(zhì)越多，污染也就越嚴(yán)重。其標(biāo)準(zhǔn)測定方法為五日法，以被檢驗的水樣在20±1℃下，5天內(nèi)的耗氧量為代表，稱其為5日生化需氧量。但該方法操作較復(fù)雜，耗時長，結(jié)果準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性差，無法滿足當(dāng)前環(huán)境監(jiān)測中快速測定的要求。而日益得到廣泛應(yīng)用的微生物傳感器法能夠快速、準(zhǔn)確測定水體中BOD，并可實現(xiàn)在線連續(xù)測定，更加適應(yīng)于現(xiàn)代環(huán)境監(jiān)測和管理的要求。但進口的該類型儀器一方面價格昂貴（約50萬人民幣左右；還須長期進口與儀器配套的生物膜）；另一方面由于我國和國外污水水質(zhì)的差別，也使該儀器很難適應(yīng)我國的水質(zhì)條件。因此，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的BOD快速監(jiān)測儀，并使其適應(yīng)我國的實際使用環(huán)境，不僅具有極為廣闊的市場前景，而且其技術(shù)也填補了我國環(huán)境監(jiān)測的一項空白。其科研和經(jīng)濟價值都十分重大。為此，我們研制出了一種適合于我國水質(zhì)特點并且可以快速、準(zhǔn)確、簡便測定BOD的全自動生化需氧量（BOD）生物傳感分析儀。 自1983年日本將BOD傳感器開發(fā)成商品，并與BOD測定儀一起出售，已使BOD快速檢測儀走上標(biāo)準(zhǔn)化和商業(yè)化的軌道。后來許多公司也致力于改進和生產(chǎn)不同的BOD傳感器，生物膜型和生物反應(yīng)器型的傳感器紛紛面世?，F(xiàn)在，歐美及日本等發(fā)達國家，BOD在環(huán)境監(jiān)測中已實現(xiàn)全自動化，但國外廠家的儀器產(chǎn)品價格昂貴、配件(如菌膜)購置困難，且由于我國和國外污水水質(zhì)的差別，也使這些儀器很難適應(yīng)我國的水質(zhì)條件，使用過程中性能不夠穩(wěn)定。目前國內(nèi)也有很多的商用BOD傳感器被制造出來投放市場，但這些BOD微生物傳感器產(chǎn)品存在著一些普遍的問題，即響應(yīng)小、測量范圍窄、穩(wěn)定性差，至今為止，還尚未用BOD生物傳感器法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的五日法，其核心問題即生物膜的制備和菌種的選擇與培養(yǎng)均未達到完善的階段。因此，如何篩選到適應(yīng)面廣，符合我國水質(zhì)特點的高效菌株，從而制得快速準(zhǔn)確的BOD檢測儀一直是此類課題研究的瓶頸問題。另一方面，監(jiān)測工作往往需要深入現(xiàn)場，如何實現(xiàn)數(shù)據(jù)實時傳輸，在線檢測BOD也一直是環(huán)境保護特別是水質(zhì)監(jiān)測中急需解決的難點問題。目前研究的熱點和核心主要集中于微生物膜的研制，其中菌種選育、微生物固定化方法的選擇成為研究的主要方向。 為解決目前BOD傳感器存在的問題，我們著手研制全自動生化需氧量（BOD）生物傳感分析儀。主要研究內(nèi)容包括： 1. 通過馴化育種、誘變育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)篩選優(yōu)勢菌種制膜，以解決國內(nèi)目前同類產(chǎn)品生物膜活性低、穩(wěn)定性差，適應(yīng)面窄的問題； 2. 采用多通道連續(xù)進樣測定，無需通過微量進樣器加樣，從而減少人工操作和系統(tǒng)誤差，使傳感器的性能更加穩(wěn)定，且為BOD的在線測定奠定技術(shù)基礎(chǔ)； 3. 減小儀器體積，使其可隨身攜帶至現(xiàn)場測定，解決常見的取樣時間和測定時間間隔過長，導(dǎo)致測定結(jié)果異常的問題； 4. 直接顯示或打印測定結(jié)果，避免稀釋法繁瑣的操作和計算，提高測定的智能化程度。 二、儀器組成 全自動生化需氧量（BOD）生物傳感分析儀主要由生物識別元件、物理換能器和多通道加樣系統(tǒng)組成，其設(shè)計原理是待測物通過生物分子識別部件將被感知物質(zhì)的非電信號轉(zhuǎn)換成可測量的電信息，再經(jīng)過放大信號處理，進行信號輸出。其中識別器件主要用來感知樣品中是否含有待測物質(zhì)，轉(zhuǎn)換器件則將識別器件感知的信號轉(zhuǎn)化為可以觀察記錄的信號(如電流大小、頻率變化、熒光和光吸收的強度等)。在待測物、識別器件以及轉(zhuǎn)化器件之間由一些生物、化學(xué)、生化作用或物理作用過程彼此聯(lián)系。當(dāng)待測物與分子識別元件特異性結(jié)合后，所產(chǎn)生的復(fù)合物(或光、熱等)通過信號轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?、光信號等，從而達到分析檢測的目的。 具體來說，全自動生化需氧量（BOD）生物傳感分析儀由液體切換系統(tǒng)、供液系統(tǒng)、供氣系統(tǒng)、恒溫系統(tǒng)、控制系統(tǒng)五大系統(tǒng)組成。其中液體切換系統(tǒng)由控制系統(tǒng)通過三個電磁閥來控制，這三個電磁閥分別控制測量、標(biāo)定、清洗。供液系統(tǒng)是一個蠕動泵，提供液體的流轉(zhuǎn)動力。供氣系統(tǒng)給流路提供氧氣。恒溫系統(tǒng)由加熱塊來保證儀器中液體、氣體以及生物傳感器溫度的恒定，使其保持在一定的溫度范圍，其中儀器的核心部件為生物傳感器。 三、儀器的工作原理 全自動生化需氧量（BOD）生物傳感分析儀的工作原理為：將微生物體固定化制作成微生物膜并作為敏感材料與氧電極緊密組合，組成分析系統(tǒng)，氧電極將生物膜產(chǎn)生的生化信號轉(zhuǎn)化成電流信號，該信號經(jīng)放大、處理后輸出。當(dāng)不給予有機底物（即處于空白溶液時）時，微生物處于內(nèi)源呼吸階段，由溶液擴散到氧電極的氧達到擴散平衡時，BOD電極輸出的電流值應(yīng)當(dāng)達到穩(wěn)態(tài)。向空白溶液中投加有機底物后，有機物被微生物膜代謝，微生物處于外源呼吸階段，由溶液擴散到氧電極的氧逐漸降低，最終達到穩(wěn)定狀態(tài)。在一定條件下電流的降低值與被測試樣濃度呈線性關(guān)系，由已知標(biāo)準(zhǔn)樣品求出兩者之間的線性關(guān)系，可測得樣品的BOD濃度。 作為生物響應(yīng)元件的微生物膜是傳感器的核心，微生物膜性能的優(yōu)劣直接影響到測試結(jié)果，因此篩選高效微生物菌種具有重要意義。其選擇的原則是只要微生物在其代謝過程中允許通過電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)傳遞電子，無論是原核生物還是真核生物都可用于構(gòu)造微生物傳感器。因此，在具體選擇時可根據(jù)污水的具體情況而定。 本次實驗采用稀釋平板法經(jīng)馴化育種從污水水樣中分離出單菌株，挑取單個菌落于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后從斜面培養(yǎng)基的菌苔挑出少許進行劃線分離，經(jīng)過反復(fù)多次后獲得菌落形態(tài)及菌體形態(tài)一致的純菌種，將其染色觀察，確定其為革蘭氏陽性菌或是革蘭氏陰性菌，再將各菌種分別添加一定量添加劑制備成微生物膜，作為生物敏感元件安裝于氧電極的透氣膜上構(gòu)成BOD生物傳感器，上機測試樣品的BOD值，通過對數(shù)據(jù)的分析處理來檢測微生物膜性能的優(yōu)劣，從而挑選出具有廣泛降解能力、性能優(yōu)良、生命周期較長且處理效果穩(wěn)定的微生物膜。通過一系列的對比測試試驗，我們得出假單胞菌是比較適合的菌種。 四、儀器的技術(shù)參數(shù) 原理：微生物電極法；測量項目：生物化學(xué)需氧量(BOD)；測量范圍：2～10000mg/L；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：≤5% ；一次測樣時間：8min；輸出信號：微生物電極0～20μA；進樣方式：由蠕動泵驅(qū)動恒速流通連續(xù)進樣；緩沖溶液消耗：2.5mL/min；所需樣品體積：>40mL；恒溫方式：由加熱器保持自動恒溫。 五、儀器測試流程 1. 微生物膜的活化。事先將干的微生物膜放在盛有500 mL 0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液燒杯中浸泡7 d，然后安裝到電極上，備用。 2. BOD的測定方法。以0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.2)為稀釋液和空白溶液，控溫32℃ ，恒速攪拌維持測量槽中溶解氧飽和，待傳感器內(nèi)源呼吸輸出電流值穩(wěn)定后加入待測試樣，采用穩(wěn)態(tài)讀數(shù)法。 3. 自動打印數(shù)據(jù)，分析電流初值（反映微生物膜活性）、電流差值（微生物降解有機物能力）及其穩(wěn)定性。 六、儀器的創(chuàng)新點 1.系統(tǒng)創(chuàng)新：此檢測儀采用多通道充氧加樣系統(tǒng)，使用變頻式充氣泵充氧復(fù)氧，通過芯片控制氧傳感器，以保證測量池內(nèi)溶解氧濃度的恒定，實現(xiàn)了加樣與充氧的同步化，不僅解決了以往流動注射式BOD檢測儀中人工加樣的系統(tǒng)誤差，而且可以保證儀器在連續(xù)測樣時的系統(tǒng)穩(wěn)定性。 2.方法創(chuàng)新：通過馴化育種、誘變育種等技術(shù)篩選優(yōu)勢菌種制膜，解決國內(nèi)目前同類產(chǎn)品生物膜活性低、穩(wěn)定性差，適應(yīng)面窄的問題。 3.技術(shù)創(chuàng)新：儀器測定可使目前各環(huán)境監(jiān)測站和污水處理廠BOD測定實現(xiàn)自動化，提高效率，減少人為誤差，并且該儀器操作簡單、體積小，可隨身攜帶至現(xiàn)場測定，解決了常見的取樣時間和測定時間間隔過長，導(dǎo)致測定結(jié)果異常的問題。 七、技術(shù)關(guān)鍵 1. 使用基因工程手段和傳統(tǒng)微生物分離、純化技術(shù)相結(jié)合，篩選適合我國水質(zhì)特點的高效微生物菌株制備生物膜； 2. 將人工間斷注射進樣方式轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗤ǖ肋B續(xù)進樣測定和分析過程，實現(xiàn)全自動化精確測定； 3. 改進傳統(tǒng)的一次化學(xué)包埋制作生物膜的方法，實現(xiàn)二次物理包埋，在多通道充氧系統(tǒng)中保持微生物活性和生物膜壽命。 八、儀器的特點與優(yōu)勢 1. 大大縮短水體中BOD值的測量時間。經(jīng)典的五日測定方法，整個測定過程需5天時間，且無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，而BOD微生物傳感器測定速度較快，在10～20min內(nèi)即可測得BOD值，并可實現(xiàn)連續(xù)在線測定，這無疑更適應(yīng)于現(xiàn)代環(huán)境監(jiān)測和管理的要求。 2. 測定結(jié)果準(zhǔn)確度高。德國的Germany STIP Iso GmbH GroB-Umstadt公司利用從廢水中分離出來的細(xì)菌制備生物反應(yīng)型BOD傳感器，測量精密度達3%。孫成新等使用流動BOD傳感檢測儀對5種不同來源的水樣進行測量，經(jīng)t-測驗后發(fā)現(xiàn)該儀器測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)稀釋法無顯著差異（誤差≤0.05）。 3. 測定結(jié)果重現(xiàn)性好。由于微生物傳感器上微生物量是一定的，故只要保持微生物活性相對穩(wěn)定且測定過程中其他條件不變，就能保證較高的測定重現(xiàn)性。林玲等（2004）實驗考察了三種不同菌膜作為生物敏感元件的微生物傳感器在30℃和pH值為7.2條件下連續(xù)4次測定BOD值為100 mg/L 的GGA溶液（ BOD標(biāo)準(zhǔn)溶液，由150 mg/L 葡萄糖溶液和150 mg/L 谷氨酸配制的混合溶液）的重現(xiàn)性，其熒光強度變化速率最大值的相對偏差分別為：2.71%，2.65%，2.2%，均在 標(biāo)準(zhǔn)分析要求的重現(xiàn)性范圍內(nèi)。Chang I. S.（2004）報導(dǎo)一種無需電子媒介物的微生物燃料細(xì)胞型傳感器。在水力停留時間為1.02h，營養(yǎng)供給速率0.35 mL/min條件下，傳感器的線性響應(yīng)范圍0～200 mg /L，恢復(fù)時間60 min。測量BOD為100 mg/L的人工廢水，響應(yīng)重現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差<10%。該傳感器測量可穩(wěn)定運行5年以上。 4. 可以測量的水質(zhì)種類、濃度范圍較廣。可對食品加工業(yè)廢水、印染工業(yè)廢水、生活污水及地表水等淡水水體中BOD進行測量，且測量濃度范圍較廣。馬莉等（2004）將從淡水中篩選出的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）馴化為適應(yīng)海水測量條件的響應(yīng)菌株，制得海水BOD傳感器，響應(yīng)線性范圍0～27 mg/L，線性相關(guān)系數(shù)0.999。Chan等（1999）采用一種耐高鹽度的酵母菌LS3，將其用聚氨基甲酰磺酸酯包埋后吸附到尼龍膜上。制成的BOD傳感器用于測定港口和海島地區(qū)含鹽度較高的工業(yè)用水和生活污水，其測定濃度范圍可達2～550 mg/L。比利時Belgium Kelma公司生產(chǎn)的BOD 傳感器采用活性污泥制作微生物膜,其測量范圍可達0～5×10 mg/L。 5. 采用變頻式充氣泵充氧復(fù)氧，通過芯片控制氧傳感器，以保證測量池內(nèi)溶解氧濃度的恒定。該設(shè)計有如下優(yōu)勢： ⑴無需通過微量進樣器加樣，減少了人工操作和系統(tǒng)誤差； ⑵采用多通道連續(xù)進樣測定，不僅使傳感器的性能更加穩(wěn)定，而且為BOD的在線測定奠定了技術(shù)基礎(chǔ)； ⑶克服了傳統(tǒng)的注射式BOD檢測儀為了使溶解氧達到飽和，必須將傳感器穩(wěn)定于溶液表面附近，導(dǎo)致復(fù)氧過程中的氣泡在上升后可能在傳感器頂端微生物膜周圍附著，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差，干擾數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的弊端。多通道充氧復(fù)氧系統(tǒng)可以保持水中溶解氧濃度恒定，所以傳感器可深入液面下，徹底消除氣泡附著的現(xiàn)象。 九、儀器的適用范圍 1.可對食品加工業(yè)廢水、印染工業(yè)廢水、釀造工業(yè)廢水、生活污水及地表水等淡水水體中BOD進行測量，且測量濃度范圍較廣。 2.可以及時為管理和決策部門掌握地表水、工業(yè)廢水和生活污水排放現(xiàn)狀提供科學(xué)決策的依據(jù)，同時也為工業(yè)企業(yè)污水治理、污水處理廠的污水治理工藝設(shè)計、控制、處理效率及時提供參數(shù)。 十、推廣前景 隨著環(huán)境保護和計算機技術(shù)、生物膜技術(shù)、基因工程技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)和壓電晶體技術(shù)的發(fā)展，生物傳感器技術(shù)也必將得到進一步發(fā)展。通過選擇新的微生物物種、合成新的生物材料以及基因工程技術(shù)的引入，都將為新型生物傳感器的出現(xiàn)提供幫助，將有助于生物傳感器的微型化、便攜化和實用化。 目前我國擁有數(shù)以千計的環(huán)境監(jiān)測站、污水處理廠及相關(guān)科研單位，這意味著BOD的快速監(jiān)測儀器具有極為寬廣的應(yīng)用前景。同時，基于目前環(huán)境監(jiān)測要實現(xiàn)快速準(zhǔn)確測定的要求以及BOD微生物傳感器檢測儀操作簡單、檢測速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、測量穩(wěn)定可靠、適用范圍廣等的特點，它能夠為環(huán)境監(jiān)測的連續(xù)性提供可能，同時降低了環(huán)境監(jiān)測的成本，因此可以在各類環(huán)境保護公司，環(huán)境監(jiān)測部門和環(huán)境執(zhí)法部門得到廣泛應(yīng)用。 十一、市場分析和經(jīng)濟效益預(yù)測： 生物傳感器商品化要具備以下幾個條件：足夠的敏感性和準(zhǔn)確性、易操作、價格便宜、易于批量生產(chǎn)、生產(chǎn)過程中進行質(zhì)量監(jiān)測。其中，價格便宜決定了傳感器在市場上有無競爭力。而在各種生物傳感器中，微生物傳感器最大的優(yōu)點就是成本低、操作簡便、設(shè)備簡單，因此其在市場上的前景是十分巨大和誘人的。 目前我國研制的BOD檢測儀存在著監(jiān)測穩(wěn)定性差，無法適應(yīng)各種污水條件的缺陷。因此在很大程度上制約了它的使用范圍和效果。究其根本原因在于BOD檢測儀中生物膜培養(yǎng)不過關(guān)。常規(guī)的利用活性污泥制備生物膜勢必存在微生物活性較低和無法適應(yīng)多種污水環(huán)境的缺點。而進口的該類型儀器一方面價格昂貴（約50萬人民幣左右；還須長期進口與儀器配套的生物膜）；另一方面由于我國和國外污水水質(zhì)的差別，也使該儀器很難適應(yīng)我國的水質(zhì)條件。因此，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的BOD快速監(jiān)測儀，并使其適應(yīng)我國的實際使用環(huán)境，不僅具有極為廣闊的市場前景，而且其技術(shù)也填補了我國環(huán)境監(jiān)測的一項空白。其科研和經(jīng)濟價值都十分重大。

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