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基本信息
- 項(xiàng)目名稱：
- 快速鑒別診斷PRRSV高熱變異株和北美株的RT-PCR檢測(cè)試劑盒的研究與應(yīng)用
- 小類：
- 生命科學(xué)
- 簡介：
- 本研究旨在建立聯(lián)合檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒高熱變異株和北美株的RT-PCR檢測(cè)方法，將各種反應(yīng)液組裝為快速檢測(cè)試劑盒，并對(duì)特異性、敏感性、重復(fù)性、保存條件等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以期實(shí)現(xiàn)該試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果顯示該試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)，較為穩(wěn)定，同時(shí)初步運(yùn)用于臨床病料的檢測(cè)，并與現(xiàn)有高致病性藍(lán)耳病的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行平行比較。
- 詳細(xì)介紹：
- 2006年6月，江西、廣東、湖南、湖北等多個(gè)省份先后發(fā)生了豬的“無名高熱病”流行，疫區(qū)養(yǎng)豬業(yè)為此遭受了巨大經(jīng)濟(jì)損失。有研究結(jié)果顯示PRRSV的基因缺失株是疫病流行的主要病原之一，核酸序列分析表明該毒株與北美株同源性僅為90%，區(qū)分變異毒株與普通毒株感染成為該病預(yù)防控制的技術(shù)關(guān)鍵。本研究目的在于： 在建立快速檢測(cè)高熱變異株和北美株的RT-PCR方法基礎(chǔ)上，研制相應(yīng)試劑盒，以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)上對(duì)“高熱病”的快速檢測(cè)，從而為更好地預(yù)防和控制該病的發(fā)生提供技術(shù)保障。 根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）核苷酸序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)出PRRSV高熱變異株和北美經(jīng)典株的上、下游引物，建立單一RT-PCR檢測(cè)方法，分別擴(kuò)增出186bp和470bp的特異性片段，在此基礎(chǔ)上建立PRRSV高熱變異株和北美經(jīng)典株雙重RT-PCR檢測(cè)方法并進(jìn)行條件優(yōu)化。在建立了兩個(gè)毒株的雙重RT-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，將這兩個(gè)毒株的特異性引物與RT-PCR反應(yīng)液混合組裝為快速檢測(cè)的試劑盒。本試驗(yàn)通過對(duì)試劑盒的敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、保存期、保存條件等技術(shù)指標(biāo)的測(cè)定，以及對(duì)臨床病料的檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果顯示該試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)，較為穩(wěn)定，能快速檢測(cè)出PRRSV，為臨床確診提供依據(jù)。
作品專業(yè)信息
撰寫目的和基本思路
- 2006年，我國多個(gè)省份先后發(fā)生了豬的“無名高熱病”流行，疫區(qū)養(yǎng)豬業(yè)為此遭受了巨大經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明其主要病原為PRRSV的基因缺失株，區(qū)分變異毒株與普通毒株感染成為該病預(yù)防控制的技術(shù)關(guān)鍵。本研究目的在于： 在建立快速檢測(cè)高熱變異株和北美株的RT-PCR方法基礎(chǔ)上，研制相應(yīng)試劑盒，以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)上對(duì)“高熱病”的快速檢測(cè)，從而為更好地預(yù)防和控制該病的發(fā)生提供技術(shù)保障。
科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處
- 1、所建雙重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)不僅能快速檢測(cè) PRRSV，同時(shí)能據(jù)所擴(kuò)增出的特異性片段大小差異區(qū)別高熱變異株和普通毒株； 2、研制試劑盒使用方便、特異性、靈敏度、可重復(fù)性和穩(wěn)定性好；
應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義
- 2006年，我國多個(gè)省份先后發(fā)生了豬的“無名高熱病”流行，疫區(qū)養(yǎng)豬業(yè)為此遭受了巨大經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明其主要病原為PRRSV的基因缺失株，區(qū)分變異毒株與普通毒株感染成為該病預(yù)防控制的技術(shù)關(guān)鍵。在建立快速檢測(cè)高熱變異株和北美株的RT-PCR方法基礎(chǔ)上，研制相應(yīng)試劑盒，以實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)上對(duì)“高熱病”的快速檢測(cè)，從而為更好地預(yù)防和控制該病的發(fā)生提供技術(shù)保障。
學(xué)術(shù)論文摘要
- 摘要: 根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）核苷酸序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)出PRRSV高熱變異株和北美經(jīng)典株的上、下游引物，建立單一RT-PCR檢測(cè)方法，分別擴(kuò)增出186bp和470bp的特異性片段，在此基礎(chǔ)上建立PRRSV高熱變異株和北美經(jīng)典株雙重RT-PCR檢測(cè)方法并進(jìn)行條件優(yōu)化。在建立了兩個(gè)毒株的雙重RT-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，將這兩個(gè)毒株的特異性引物與RT-PCR反應(yīng)液混合組裝為快速檢測(cè)的試劑盒。本試驗(yàn)通過對(duì)試劑盒的敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、保存期、保存條件等技術(shù)指標(biāo)的測(cè)定，以及對(duì)臨床病料的檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果顯示該試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)，較為穩(wěn)定，能快速檢測(cè)出PRRSV，為臨床確診提供依據(jù)。 關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸障礙綜合征、RT-PCR、檢測(cè)試劑盒
獲獎(jiǎng)情況
- 榮獲第六屆“挑戰(zhàn)杯”校級(jí)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽一等獎(jiǎng)； 榮獲第十屆“挑戰(zhàn)杯”省大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽一等獎(jiǎng)；
鑒定結(jié)果
參考文獻(xiàn)
- RT-PCR技術(shù)。最近國外和國內(nèi)均建立了RT-PCR檢測(cè)方法。國外應(yīng)用PCR診斷PRRSV已取得很大進(jìn)展，許多學(xué)者根據(jù)PRRSV不同的ORF序列，設(shè)計(jì)了不同引物，建立了檢測(cè)PRRSV核酸的RT-PCR方法，并獲得較高的敏感性和特異性。一些學(xué)者在ORF1b的基礎(chǔ)上擴(kuò)增引物，建立了RT-PCR方法來檢測(cè)PRRSV的RNA核苷酸，并將其與病毒分離和血清學(xué)方法進(jìn)行比較，證明RT-PCR方法比其它兩種方法更敏感更有效。我國婁高明等[12]根據(jù)PRRSV的ORF7序列，設(shè)計(jì)一套引物建立了RT-PCR方法，試驗(yàn)結(jié)果證明其效果較好，且可從基因水平上區(qū)分PRRSV美洲型和歐洲型，而且對(duì)國內(nèi)疑似為PRRSV送檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，確定其為美洲型。 婁高明,杜偉賢,謝明泉,等.豬繁殖與呼吸綜合征RT-PCR診斷方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2000, (3):141-144.
同類課題研究水平概述
- RT-PCR技術(shù)。最近國外和國內(nèi)均建立了RT-PCR檢測(cè)方法。國外應(yīng)用PCR診斷PRRSV已取得很大進(jìn)展，許多學(xué)者根據(jù)PRRSV不同的ORF序列，設(shè)計(jì)了不同引物，建立了檢測(cè)PRRSV核酸的RT-PCR方法?？梢灾苯訌腜AM分離培養(yǎng)物、臨床樣品(肺泡巨噬細(xì)胞、血清和血漿，肺臟組織以及精液等)中擴(kuò)增出預(yù)期的片斷，并獲得較高的敏感性和特異性。一些學(xué)者在ORF1b的基礎(chǔ)上擴(kuò)增引物，建立了RT-PCR方法來檢測(cè)PRRSV的RNA核苷酸，并將其與病毒分離和血清學(xué)方法進(jìn)行比較，證明RT-PCR方法比其它兩種方法更敏感更有效，在感染后24h就可檢測(cè)出病毒RNA核苷酸，而在檢測(cè)血清樣品中，當(dāng)可能存在最低濃度的循環(huán)病毒時(shí)，在感染初期及感染晚期(28d)經(jīng)RT-PCR檢測(cè)為陽性，而用病毒分離法檢測(cè)時(shí)，其中一些樣品卻為陰性。同時(shí)他們還建立了針刺耳靜脈，用濾紙片收集全血取樣的方法，這樣可以減少污染機(jī)會(huì)，且可進(jìn)行大量豬群的檢測(cè)。我國婁高明等[12]根據(jù)PRRSV的ORF7序列，設(shè)計(jì)一套引物建立了RT-PCR方法，試驗(yàn)結(jié)果證明其效果較好，且可從基因水平上區(qū)分PRRSV美洲型和歐洲型，而且對(duì)國內(nèi)疑似為PRRSV送檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，確定其為美洲型。因此PRRSV山東分離株ORF7基因的原核表達(dá)與RT-PCR快速檢測(cè)方法無疑是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的診斷方法。 孔繁德，王英，陳瓊等[14]根據(jù)豬瘟病毒（CSFV）和豬藍(lán)耳病（PRRSV）的基因保守序列設(shè)計(jì)了2對(duì)針對(duì)這2種病毒的特異引物，并建立了多重RT—PCR方法，分別對(duì)其最佳反應(yīng)條件、特異性及敏感性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明能同時(shí)擴(kuò)增得到2條與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的167bp（CSFV）和320bp（PRRSV）特異性條帶，同時(shí)具有較好的特異性；敏感性檢測(cè)結(jié)果表明，臨床陽性的樣品提取的核酸稀釋1000倍后仍能檢測(cè)出CSFV和PRRSV。本方法的建立對(duì)于這2種病毒病的早期快速檢測(cè)具有十分重要的意義。
