- 項(xiàng)目名稱：
- 中藥材的鑒別技術(shù)——DNA分子診斷
- 簡(jiǎn)介：
- ：隨著生命科學(xué)研究的不斷突破，DNA分子診斷技術(shù)鑒定中藥的研究得到了極大的發(fā)展，并正逐漸成為中藥鑒定的一種方法。由于DNA分子信息量高，所以DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別中藥材有其獨(dú)到的優(yōu)越性。 制成芯片固定了足夠多的來(lái)自不同中藥樣本的特有基因序列，就可以用于多種中藥樣本的鑒別，使分析時(shí)間大大減少提高了鑒定效率。
- 詳細(xì)介紹：
- 中藥品種繁多，應(yīng)用歷史悠久，產(chǎn)區(qū)廣泛。由于地理和歷史的原因，藥材品種混亂，如僅《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版收載的534種中藥材，加之中藥的同名異物或同物異名現(xiàn)象普遍存在以及偽品、混淆品和誤用品等因素，對(duì)中藥的化學(xué)成分和藥理作用的研究、制劑生產(chǎn)、臨床...(查看更多)療效及推廣使用等都有直接影響，嚴(yán)重影響了中醫(yī)藥的信譽(yù)。同時(shí)，即使是同種藥材，由于產(chǎn)地不同、野生和栽培以及生長(zhǎng)年限不同表現(xiàn)出質(zhì)量和療效上的差異，這些問(wèn)題為中藥材鑒別方法提出了新的挑戰(zhàn)，依賴經(jīng)典形態(tài)分類以及傳統(tǒng)鑒別方法已無(wú)法滿足鑒別的需要。隨著各種先進(jìn)儀器以及分子生物學(xué)的發(fā)展，各種新的鑒別方法亦紛紛推出，如紅外光譜鑒別、化學(xué)指紋圖譜鑒別以及DNA分子標(biāo)記鑒別等，中藥材鑒別領(lǐng)域顯示出了蓬勃的生機(jī)。其中以DNA分子標(biāo)記鑒別最具有發(fā)展特點(diǎn)。
1. DNA分子診斷的類型
1.1依據(jù)多態(tài)性的檢測(cè)手段分為三類
①限制內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)(RFLP)。
②基于多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)的分子標(biāo)記(PAPD)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA擴(kuò)增產(chǎn)物指紋DNA(DAF)等。
③PCR-RELP技術(shù)的結(jié)合AFLP技術(shù)。
1.2根據(jù)檢測(cè)DNA的多態(tài)性的方法分兩類
一類直接測(cè)序DNA序列標(biāo)記法，一類間接方法反映序列差異。此外，還有依據(jù)分析對(duì)象分為兩類：采用檢測(cè)基因組DNA多態(tài)RAPD、AP-PCR、AFLP；檢測(cè)特定片段DNA的多態(tài)，即以特定的基因(或短片段的DNA)為研究對(duì)象。
2 如何運(yùn)用RAPD技術(shù)
2.1 DNA的提取
DNA提取目前主要存在兩種提取方法，其中CTAB法能很好去除多糖雜質(zhì)。中南大學(xué)科研人員對(duì)人參、西洋參運(yùn)用CTAB法提取DNA時(shí)，提高了CTAB裂解液濃度，有利于核酸與蛋白質(zhì)完全裂解及CTAB-DNA復(fù)合物形成，通過(guò)增加PVP及β巰基乙醇的含量，防止植物油細(xì)胞中多酚類物質(zhì)氧化成色素。在低濃度鹽的條件下，CTAB-DNA復(fù)合物發(fā)生沉淀，通過(guò)離心可去除多糖類、蛋白質(zhì)、色素及多酚類成
2.2準(zhǔn)確的基因片段序列
rDNA基因被用作研究科內(nèi)、屬內(nèi)、種內(nèi)間的分子系統(tǒng)演化及物種鑒別的重要分子標(biāo)記。rDNA在真核生物中是高度保守的，其編碼區(qū)(18S，5.8S，26S)的序列具有高度的同源性，在系統(tǒng)上主要用于屬于系統(tǒng)學(xué)研究，而非編碼區(qū)(ITS1，ITS2)的序列常用與種間及種下等級(jí)的系統(tǒng)學(xué)研究。序列可變區(qū)包括matk基因編碼區(qū)和trnk外顯子與matk內(nèi)含子之間區(qū)域。例如，中山大學(xué)生命科學(xué)院采用端終止法對(duì)杜仲分子rRNA基因(25SrRNA)5′，端基因進(jìn)行測(cè)序
2.3數(shù)據(jù)分析
測(cè)序后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，這是判斷藥物近緣關(guān)系的關(guān)鍵一步，利用遺傳分化指數(shù)(DC)值和分化指數(shù)比（PDC）值比較不同類型遺傳分化度。無(wú)論從樹(shù)狀關(guān)系還是遺傳分析的結(jié)果都能反映出不同種間的親源關(guān)系，同時(shí)也表現(xiàn)出內(nèi)遺傳分析上相對(duì)一致性。研究人員認(rèn)為通過(guò)建立RAPD分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行樣品的判斷分析，這也是RAPD技術(shù)真正成為中藥鑒定手段的有效途徑。
3 以RAPD為基礎(chǔ)的可重復(fù)的AFLP技術(shù)
在分子診斷技術(shù)中還有一種更新的技術(shù)，在RAPD的基礎(chǔ)上與其他的技術(shù)相結(jié)合，得到一種重復(fù)性好、靈敏度高的DNA指紋圖譜，它的具體過(guò)程是：限制內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)(RFLP)與多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的結(jié)合，用一個(gè)人工接頭與限制酶切的基因組DNA片段進(jìn)行連接，制AFLP模板DNA，合成一系列3′，末端隨機(jī)改變各堿基的PCR引物進(jìn)行PCR指紋圖譜。目前人們成功利用AFLP法構(gòu)建了人參、西洋參等基因組DNA指紋圖譜。
4. DNA分子診斷在藥材鑒別中的運(yùn)用
隨著時(shí)間的推移，RAPD等方法逐漸推出舞臺(tái)。無(wú)須預(yù)先知道基因組信息的特點(diǎn)，使RAPD在中藥材分子鑒定上成為最主要的方法，許多在RAPD基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的方法也顯示了極好的前景。目前，將得到的標(biāo)準(zhǔn)物DNA序列制作成基因芯片，通過(guò)獲取不同中藥樣本的特異性基因序列，極大地用于中藥品種的快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化鑒別，如果在單片芯片上固定了足夠多的來(lái)自不同中藥樣本的特有基因序列，則此種芯片就可以用于多種中藥樣本的鑒別，使分析時(shí)間大大減少提高了鑒定效率
但目前對(duì)中藥的特征DNA序列知之甚少，遠(yuǎn)不能滿足基因序列分析鑒定中藥的要求。要實(shí)現(xiàn)基因芯片技術(shù)鑒定中藥，必須全面研究中藥的基因組特征，實(shí)現(xiàn)藥材真?zhèn)舞b別系統(tǒng)基因庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)基因圖譜的建立。相信這項(xiàng)技術(shù)在不久的將來(lái)將會(huì)實(shí)現(xiàn)。
(收起)
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